Как построить мозг

То, что делает нас людьми, находится среди 1,4 кг желтоватой ткани человеческого мозга. Здесь рождаются наши мысли, здесь мы ощущаем любовь или ненависть и отсюда появляются самые творческие и самые злые человеческие идеи. Эта структура, по форме похожая на грецкий орех, — самый сложный орган из когда-либо созданных природой. В мозге содержится около 86 млрд нервных клеток (нейронов), которые должны рождаться в определенное время, мигрировать в нужное место и образовывать правильные связи, чтобы мы были живыми и здоровыми.

Сложнейшая задача для современной биологии — понять, как развивается человеческий мозг и как он работает. Более чем за столетие, прошедшее с момента появления нейробиологии, основную часть того, что мы узнали об этом органе, мы почерпнули из экспериментов на животных. Ученые оправдывают такой подход тем, что у мышей и людей одинаковое устройство мозга: он состоит из тех же типов клеток, а общие для этих видов нервные процессы происходят в одних и тех же структурах. Но есть одно принципиальное различие между людьми и грызунами: мышиный мозг имеет гладкую поверхность, а у человеческого — много складок.

Со стороны такое различие может показаться незначительным. Но нейробиологи считают, что складчатость имеет принципиальное значение для работы человеческого мозга. Она позволяет в том же объеме разместить значительно большее количество нейронов, что характерно для всех умных животных, таких как обезьяны, кошки, собаки и китообразные. Специалисты по эволюционной биологии показали, что складчатость обусловлена еще одним различием между мышиным и человеческим мозгом: во многих его областях нейроны образуются из определенных клеток- предшественников, которых у мышей крайне мало.

Когда исследователи пытаются изучать механизмы человеческих заболеваний на животных, то воспроизводят у мышей распространенные генетические мутации, связанные с серьезными неврологическими расстройствами у людей. Однако из-за различий в устройстве мозга у грызунов подобные мутации могут почти не вызывать нарушений. Если мутации влияют на развитие или поддержание структур, свойственных именно человеческому мозгу, или на работу тех типов клеток, которые характерны для человека, то эксперименты на животных будут обречены на провал. Действительно, уникальность свойств человеческого мозга — одна из причин, почему исследования на грызунах не дали никаких эффективных методов лечения таких заболеваний, как шизофрения, эпилепсия и аутизм.

Информацию о человеческом мозге обычно получают из экспериментов на мышах, крысах и других животных. У таких животных мозг похож на человеческий, но у него нет большого количества складок на поверхности, что влияет на особенности работы нервной системы.

Из-за уникальности строения человеческого мозга, если ограничиваться исследованиями на грызунах, не удается найти новые пути лечения многих заболеваний начиная от шизофрении и заканчивая болезнью Альцгеймера. Поэтому ученые ищут другие способы проведения нейробиологических экспериментов.

Один из возможных вариантов — вырастить крупный фрагмент развивающегося мозга в лаборатории. С помощью таких органоидов ученые, по-видимому, смогут добыть информацию, которую нельзя получить в экспериментах на мышах. Этот подход уже был использован при исследовании вируса Зика

Осознание, что мозги мыши и человека различаются, побудило искать более информативные пути для проведения нейробиологических экспериментов. Недавно в моей лаборатории возник интересный подход: выращивание больших фрагментов развивающегося мозга «в пробирке». Такие структуры (органоиды) стали для нейробиологов моделью человеческого мозга, с чьей помощью можно добыть информацию, которую не удается получить, проводя исследования на мышах. Ученые обретают возможность наблюдать, что происходит, если на такой «мозг в пробирке» (его еще называют мини-мозгом) воздействует, например, вирус Зика, способный нарушать развитие мозга плода, когда беременная женщина заражена. Или же с помощью методов генной инженерии исследователи могут смоделировать на этом органоиде влияние на мозг неврологических заболеваний.

Мозг в пробирке

В моей лаборатории работа над созданием органоидов началась в 2012 г., когда Мэдлин Ланкастер (Madeline Lancaster) придумала способ воспроизвести «в пробирке» основные процессы развития мозга, происходящие у человеческого зародыша в течение первых десяти недель. Мы использовали человеческие стволовые клетки, обладающие замечательным свойством плюрипотентности. Плюрипотентные стволовые клетки — это однотипные клетки, характерные для эмбриона на ранних сроках. При соблюдении определенных условий из них можно получить любой тип тканей: нервную, мышечную, кровь, костную ткань или любую другую. У плода такие клетки сохраняют плюрипотентность всего несколько дней. Но, работая с культурой клеток в лаборатории, исследователи могут поддерживать их в этом состоянии, а потом получать из них любой нужный тип клеток.

Для начала мы поместили клетки в жидкость, содержащую все вещества, необходимые для выращивания нейроэктодермы — той части плода, из которой потом формируется нервная система. Когда клетки образовали шар, называемый «эмбриоидное тельце», мы поместили его в удивительную субстанцию — матригель. Данный гель получают с помощью культуры клеток, выделенных из опухоли хрящевой ткани мыши, и он похож на мембрану, на которой располагаются клетки у плода. Матригель в изобилии содержит факторы, которые одновременно стимулируют клетки делиться и не дают им погибнуть, обеспечивая достаточно жесткий каркас, чтобы удерживать клетки, но и в меру гибкий, чтобы клетки могли его преобразовывать и в свою очередь сами изменять свою форму.

Эксперименты привели к поразительным результатам. После того как эмбриоидные тельца были оставлены в геле, они выросли в трехмерные белые шарики из ткани, похожей на эмбриональный человеческий мозг. Под воздействием соответствующих химических сигналов, запускающих развитие мозга у плода, стволовые клетки образуют точную копию конечного мозга человека — области, отвечающей за высшие психические функции. Он состоит из коры (крупной складчатой внешней структуры) и сосудистого сплетения желудочков мозга (там образуется спинномозговая жидкость). Кроме того, мы обнаружили другие структуры, которые в процессе развития мозга руководят миграцией клеток. Такую функцию выполняют медиальный и латеральный ганглиозные бугорки, участвующие в образовании тормозных клеток (интернейронов) и гиппокампа.

Клетки в растущем органоиде располагаются так же, как в мозге восьми-десятинедельного человеческого плода. В некоторых случаях у органоидов даже вырастают маленькие глазные бокалы — вогнутости в ткани, содержащей пигменты, так бывает, когда начинает формироваться человеческий глаз. Клетки делятся, и образуются разные виды нейронов, такие же как в мозге эмбриона. От нервных клеток идут аксоны — длинные «провода», создающие контакты с другими нейронами и образующие активную нервную сеть. Перед тем как сформируется сеть, нейроны мигрируют из одного места в другое, в основном таким же образом, как они перемещаются в мозге плода. Соответственно, можно выяснить, что произойдет, если нейроны окажутся в неправильном месте, как это часто бывает при психических заболеваниях.

На плечах гигантов

Идея самоорганизации ткани в культуре клеток не нова. Как и большинство научных открытий, сегодняшний прорыв в создании органоидов стал возможен благодаря многолетним исследованиям, которые начались более века назад. Еще в 1907 г. зоолог Генри Уилсон (Henry Wilson) показал, что некоторые примитивные животные, такие как губки, могут собирать сами себя после того, как их разорвали на отдельные клетки. Это позволяло думать, что и мозг наделен программой для сборки своих многочисленных деталей.

В 1939 г. Иоганнес Хольтфретер (Johannes Holtfreter) обнаружил, что если эмбрион лягушки разделить на отдельные клетки, то они будут искать друг друга и восстановят форму. Это привело к бурному расцвету исследований «реагрегации» в 1980-х гг., когда пытались получить в лаборатории сложные органы животных, такие как сетчатка и даже кора, объединив разные типы клеток.

Опираясь на ранние эксперименты по реагрегации, в 2006-2010 гг. покойный японский ученый Йошики Сасаи (Yoshiki Sasai из Центра биологии развития Института физико-химических исследований RIKEN первым использовал плюрипотентные стволовые клетки для выращивания нервной ткани и особенно человеческой сетчатки. На самом деле, в нашей технологии выращивания мозгового органоида объединены методы Сасаи и открытие

Ханса Клеверса (Hans Clevers) из Утрехтского университета. Клеверс посадил стволовые клетки в матригель, чтобы получить систему, которую можно использовать для выращивания тканей кишечника, желудка и даже печени и поджелудочной железы.

Помимо методов из предыдущих исследований мы используем недавно разработанную технологию, которая совершила кардинальный переворот в биомедицинских исследованиях. Это метод перепрограммирования клеток, автор которого — японский нобелевский лауреат Синъя Яманака (Hans Clevers) из Киотского университета. С помощью простой последовательности генетических манипуляций производят перепрограммирование уже взрослых клеток организма обратно в плюрипотентные стволовые клетки, и так можно сделать практически с любой клеткой, будь это кожа или кровь. Стволовые клетки, полученные из образца кожи или крови, можно превратить в разные типы клеток мозга и вырастить из них органоид. При таком подходе нет необходимости использовать клетки, полученные из эмбрионов. С помощью перепрограммирования можно вырастить органоид из клеток пациента, имеющего генетическое заболевание, и сравнить его со здоровым, чтобы выяснить причины болезни, поскольку генетическое нарушение в клетках пациента повлияет на органоид так же, как на развивающийся плод. И мы уже использовали данную технологию, чтобы изучить микроцефалию — заболевание, при котором люди рождаются со значительно уменьшенным мозгом. Мы обнаружили, что органоиды, выращенные из клеток больных с микроцефалией, значительно меньше нормы. Поскольку возможно выращивать клетки пациентов в неограниченном количестве, мы можем детально проанализировать последовательность молекулярных событий, приводящих к микроцефалии у плода. Это применимо и для других заболеваний мозга: используя клетки пациентов для выращивания органоидов, нейробиологи смогут лучше понять, какие нарушения в развитии мозга приводят к шизофрении, эпилепсии и другим нарушениям, которые сложно или невозможно изучать на животных.

Могут пригодиться и органоиды, полученные из перепрограммированных клеток здоровых людей. Например, их уже эффективно использовали во время нынешней эпидемии, вызванной вирусом Зика. Предполагалось, что из-за него у женщин, зараженных вирусом во время беременности, родилось много детей с микроцефалией. Благодаря исследованиям с использованием органоидов, сначала в Бразилии, а затем в США, установлено, что вирус действительно может вызывать микроцефалию. Если бы не новые технологии, это так и оставалось бы просто предположением. При заражении вирусом Зика нервные клетки умирали, и в результате органоиды оказывались значительно меньше, чем незараженные, совсем как те, что выращены из клеток наших пациентов с микроцефалией.

Органоиды, скорее всего, помогут и в других исследованиях вируса Зика. Можно вырастить много органоидов и заразить их разными штаммами вируса из разных частей света, чтобы попытаться понять, почему в одних регионах он вызывает микроцефалию, а в других — нет. Мы можем использовать их и для того, чтобы выяснить, почему только у некоторых людей он вызывает развитие этой болезни. Органоиды можно применять для поиска мест присоединения вируса к клетке (рецепторов), которые вирус использует для проникновения в клетку. Органоиды могут пригодиться и чтобы протестировать на них будущие лекарства от вируса Зика прежде, чем проводить клинические испытания на пациентах.

Второе направление, которое очень выиграет от применения органоидов, — это генная инженерия, то есть совокупность методов, позволяющих ученым изменять гены в клетках. Создав органоиды с мутацией, предположительно вызывающей заболевание, исследователи выяснят, действительно ли это генетическое изменение приводит к болезни. В итоге ученые смогут оценить, получится ли здоровый органоид, если исправить мутацию, и если да, то новые способы лечения будут направлены именно на противодействие ее влиянию.

Нейробиологи надеются использовать такой мини-мозг еще и для разработки лекарственных средств. С помощью данной технологии можно оценить, оказывает ли лекарство нужное влияние на ткани мозга. Это избавит от необходимости проводить тесты на животных и позволит сэкономить средства, затрачиваемые на разработку препаратов. Используя органоиды, ученые смогут выявить нежелательное влияние лекарств на формирование мозга и предотвратить их назначение беременным женщинам. Если бы печально известный талидомид, нарушающий развитие мозга плода на ранних сроках беременности и вызывающий другие врожденные дефекты, был бы протестирован таким образом, его, вероятно, не использовали бы для борьбы с утренней тошнотой при беременности в конце 1950-х — начале 1960-х гг.

Органоиды — бесценный инструмент для специалистов в области эволюционной биологии. Их можно использовать для выявления генов, отвечающих за увеличение размера мозга человека по сравнению с другими приматами. Благодаря сравнению геномов человека и приматов уже выявлены гены, которые, возможно, отвечают за уникальные для человека когнитивные способности, такие как язык. Но пока предположения о механизме работы этих генов остаются умозрительными. Теперь ученые могут заменить в органоиде некоторые человеческие гены обезьяньими и увидеть, как они влияют на развитие мозга. Или, наоборот, в органоид, полученный из клеток обезьяны, можно ввести человеческий ген или даже большой фрагмент генома, чтобы заставить органоид работать более человеческим способом.

Есть ли основания для беспокойства?

Я уверен, что идея выращивания мозга в пробирке вызовет чувство брезгливости у многих людей. После фильмов вроде «Матрицы» возникает подозрение, что выращенные в лаборатории мозги смогут думать или даже быть личностью. Это пустые страхи. Вероятность того, что у подобного мозга возникнет собственное мышление, равна нулю. Органоид — это не гомункулус в колбе и не будет им никогда даже в далеком будущем. Чтобы сформировать собственную мысленную модель реальности, любое сознание должно иметь возможность обрабатывать информацию от органов чувств. Органоиды не способны ни видеть ни слышать, они не получают никаких сенсорных сигналов. Даже если бы мы подключили к ним камеру и микрофон, входящую зрительную и слуховую информацию нужно было бы перевести в форму, понятную клеткам мозга в пробирке, но, судя по всему, это нерешаемая техническая задача.

Органоиды — это не работающие мозги, а только куски ткани, в которых на молекулярном и клеточном уровнях детально воспроизводится работа органа. Они похожи на фрагменты ткани, удаленные во время хирургической операции, а не на сознательных существ.

Однако выращивание органоидов поднимает некоторые этические и правовые вопросы. Все органоиды получены из клеток, взятых у лиц, обладающих определенными юридическими правами. Поэтому при проведении подобных исследований в любой цивилизованной стране должен выполняться единый порядок правовых процедур, принятый для работы с биологическими образцами, полученными от пациентов. Конечно, пациенты должны дать свое согласие, прежде чем их клетки будут использованы для исследований. Те же правила применяют и при работе с органоидами. Но даже тогда, когда донорам подробно объяснили полезность экспериментов, им может быть некомфортно от мысли, что из их клеток вырастили мозгоподобные структуры.

Что дальше?

Преимущества этой клеточной технологии перевешивают любые возможные недостатки. Мозговые органоиды дают возможность проводить реалистичные медицинские и токсикологические эксперименты с человеческими тканями, не занимаясь опытами на животных. И все же мы с коллегами хотели бы улучшить получаемые структуры. Например, сейчас у органоидов нет кровеносных сосудов. Для ранних стадий развития это неважно, но со временем клетки начинают погибать от недостатка кислорода и питательных веществ. Теоретически можно было бы сделать кровеносные сосуды с помощью новых технологий 3D-печати или выращивая их из стволовых клеток. Известно, что кровеносные сосуды вырастают в мозге. Возможно, данный процесс удастся воспроизвести в трехмерной клеточной культуре.

Кроме того, нам хотелось бы, чтобы органоид, подобно настоящему мозгу, имел верхнюю, нижнюю, переднюю, заднюю, правую и левую стороны. В отличие от настоящего эмбриона, у которого есть явно выраженные оси тела, у органоида их нет. Поэтому он развивается в случайных направлениях и отдельные его части по-разному ориентированы. В развивающемся мозге сложные системы сигналов создают мозгу ощущение верха и низа, и те же химические вещества могли бы оказать схожее влияние на органоид. С помощью современных методов биотехнологии можно создавать культуры тканей, в которых есть химические вещества, необходимые для стимуляции развивающихся клеток. Благодаря таким технологиям можно было бы в итоге получить органоиды, где был бы передний мозг с одного конца и задний — с противоположного.

Пытаясь найти пути преодоления этих преград, мы уже начали продвигаться вперед. Мы достигли того, о чем несколько лет назад можно было только мечтать. Органоиды уже используются для выявления механизмов заболевания и помогают при разработке лекарств. Возможность выращивать фрагменты мозга и работать с живыми образцами открыла совершенно новую страницу в биологических исследованиях, создав культуры клеток, значительно более похожие на настоящий орган, и предоставив в некоторых случаях разумную альтернативу опытам на животных.