Американские ученые впервые исследовали роль «корней» рака — раковых стволовых клеток — в развитии первичной опухоли и метастазов при раке толстой и прямой кишки. Их эксперименты показали, что элиминация этих клеток блокирует рост опухоли, хотя и не приводит к ее деградации. Кроме того, оказалось, что наличие раковых стволовых клеток критически важно для развития и поддержания метастазов. Полученные данные указывают на потенциальный новый способ терапии как первичных раковых опухолей, так и неизлечимых в настоящее время метастазов.

Сейчас уже очевидно, что полная и окончательная победа над раком невозможна. Дело в том, что в самой природе живой клетки заложена способность превратиться в злокачественную. Причинами этого превращения служат, как правило, мутации в генах, продукты которых обеспечивают контроль за ростом клетки и предотвращают ее избыточное размножение. Известно уже довольно много различных раков, и наборы генов, мутации в которых вызывают каждый конкретный тип заболевания, как правило, неодинаковы. Поэтому для лечения различных раков применяются разные средства. Исследователи постоянно разрабатывают новые подходы и методы, позволяющие более эффективно и выборочно (селективно) подавлять рост раковых клеток, не затрагивая нормальные.

Рак толстой и прямой кишки (колоректальный рак) — один из самых распространенных и смертоносных видов рака. Его клеткам свойственны инактивирующие мутации в генах супрессоров опухолей APC, TP53 и SMAD4 и активирующие мутации в онкогенах KRAS.

Среди неспециалистов сложилось мнение, что все клетки в составе раковой опухоли имеют одни и те же мутации и все как одна часто делятся. На самом деле, если судить по данным последних лет, клетки опухоли различаются по своим функциям и способностям. Всего лишь небольшая их часть имеет онкогенный потенциал, то есть способна давать начало новым опухолям. Это так называемые раковые стволовые клетки (РСК, см. Cancer stem cells). Обычные средства для химиотерапии на них почти не действуют, так что именно они остаются в живых после химического уничтожения опухолей и обеспечивают в таких случаях рецидивы заболевания. (Подробнее о раковых стволовых клетках можно прочитать в новости Доказано существование раковых стволовых клеток и в статье И. Щеглова В центре внимания раковые стволовые клетки.)

Рис. 1. Роль стволовых клеток колоректального рака (Lgr5+ РСК, показаны красным) в развитии первичной опухоли и метастазов. a — инъекции дифтерийного токсина (DT treatment) генно-модифицированным мышам тормозят рост подкожных опухолей (Subcutaneous tumour), вызванных введением чувствительных к DT онкогенных органоидов. При этом размеры этих опухолей не уменьшаются — функцию стволовых клеток по поддержанию опухоли берут на себя другие клетки. Если действие DT прекращается, в опухолях вновь появляются Lgr5+ РСК, и рост этих опухолей возобновляется. b — инъекции DT мышам, у которых уже развились опухоли прямой кишки из-за введения онкогенных органоидов, тормозят развитие метастазов в печени. с — если метастазы в печени мышей уже развились, инъекции DT вызывают их деградацию. После прекращения введения токсина рост метастазов не возобновляется. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

РСК обнаружены во многих злокачественных опухолях и, очевидно, могли бы быть привлекательными мишенями для терапии рака. Ведь, по логике, их уничтожение резко снижает вероятность рецидивов. Тем не менее, долгое время оставалось неясным, можно ли на практике воздействовать на них в клинических целях. До сих пор не было разработано экспериментальных систем селективной элиминации РСК.

Помимо прочего, не было уверенности в том, откуда они берутся — то ли образуются из уже дифференцированных клеток, в которых возникли онкогенные мутации, то ли из «обычных» стволовых клеток. Меж тем, это вопрос принципиальный. Чтобы знать, как выборочно уничтожить РСК, надо понимать, какие молекулы-маркеры они несут на своей поверхности. (Маркеры — «визитные» карточки клеток определенного типа; они, как правило, не присутствуют в заметных количествах на клетках других типов.) В случае, если РСК происходят от дифференцированных клеток, набор маркеров был бы одним. А если раковым стволовым клеткам дают начало другие стволовые клетки, то, вероятно, и маркеры у РСК и их предшественников весьма похожи.

Девять лет назад для колоректального рака было установлено, что его опухоли происходят от клеток с молекулами Lgr5 на поверхности. Lgr5 — это сокращение для «сопряженный с G-белком рецептор 5, содержащий обогащенные лейцином повторы» (leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5). Этот маркер вообще характерен для ряда стволовых клеток, расположенных в различных органах, не только в эпителии стенок кишечника. Так что роль Lgr5⁺-клеток в образовании опухолей толстой и прямой кишки может служить аргументом в пользу того, что по крайней мере для этого типа рака раковые стволовые клетки образуются из «просто стволовых». Тем не менее, точно не было известно, выполняют ли Lgr5⁺-клетки функции раковых стволовых клеток. Поэтому работающий в США онколог Фелипе де Соуза э Мело (Felipe de Sousa e Melo) и его коллеги провели исследование с целью выяснить, как потеря Lgr5-несущих РСК влияет на развитие (а не возникновение) раковых опухолей.

Ранее тот же коллектив авторов с помощью методов генетической инженерии получил линии лабораторных мышей, у которых в Lgr5⁺ стволовые клетки эпителия кишечника были введены гены рецептора дифтерийного токсина (diphteria toxin, DT) и флюоресцирующего белка. Дифтерийный токсин, вводимый таким мышам, селективно разрушал Lgr5-несущие клетки (H. Tian et al., 2011. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable).

В новой работе авторы получили in vitro из эпителия толстого кишечника культуры органоидов — трехмерных многоклеточных структур, напоминающих миниатюрные органы. С помощью методов генетической инженерии в клетки органоидов вводили мутации, которые наиболее часто встречаются при колоректальном раке (рис. 2). Мутантные органоиды имплантировали мышам под кожу.

Рис. 2. Вверху: введение мутаций в органоиды с помощью технологии CRISPR/Cas. Буквы указывают на гены, в которые вводили мутации: A — Apcmin/+, K — KrasLSL-G12D/+, V — Vil1Cre, L — Lgr5DTR/eGFP, P — Trp53, S — Smad4. Зеленым цветом обозначены клетки Lgr5-GFP+ среди единичных клеток (single cells) и в органоидах (organoids). В середине:состояние культур мутантных клеток и органоидов, из которых отбирали последние (длина масштабного отрезка 500 мкм). Внизу слева: скорость роста подкожных опухолей, вызванных органоидами с разными наборами мутаций, вертикальна ось — средний объем опухоли (в мм3), горизонтальная ось- время (в днях). Внизу справа: введение дифтерийного токсина (DT, серый график) заметно тормозит рост подкожных AKVPL-опухолей по сравнению с мышами в контрольной группе, которым вводили физраствор (saline, черный график); показаны средние объемы опухолей (в мм3) в зависимости от времени (в днях). Видно, что после прекращения инъекций DT (DT off) опухоли начинали быстро расти. Изображения из обсуждаемой статьи в Nature

Чем больше различных свойственных колоректальному раку мутаций было введено в органоиды, тем активнее росли вызванные ими опухоли. После того, как развивались опухоли, животным вводили DT, чтобы вызвать разрушение Lgr5⁺опухолевых клеток. Хотя опухоли вследствие этого прекращали расти, они не деградировали полностью. Следовательно, какие-то другие, не экспрессирующие Lgr5 и пока не идентифицированные клетки могли компенсировать утрату Lgr5⁺клеток и поддерживать размеры опухоли. Количественное определение спектра мРНК, транскрибируемых в клетках подавленной дифтерийным токсином опухоли, показало, что в таких клетках активировался сигнальный путь Мус, известный как стимулятор роста. Если же введение DT прекращали, Lgr5⁺ клетки появлялись вновь и рост опухоли возобновлялся с прежней скоростью.

Уже давно высказывалось предположение, что РСК могут участвовать не только в образовании раковых опухолей, но и в формировании метастазов. Но до сих пор это предположение не было проверено на практике. Теперь эксперименты авторов рассматриваемой работы показали: опухоли, развившиеся из введенных под кожу органоидов, метастазов не давали. Чтобы глубже изучить проблему, исследователи провели ортотопную трансплантацию (пересадку тканей в область тела реципиента, гомологичную области тела донора) мутантных органоидов в ткань прямой кишки мышей. В случае органоидов AKVPL опухоли возникали только по месту имплантации (буквами обозначены гены, в которые были внесены мутации, см. рис. 2). Напротив, органоиды AKVPSL не только индуцировали опухоли по месту имплантации, но и в течение трех недель давали метастазы в печень. Если в случае пересадки AKVPL мыши практически не погибали, то грызуны с AKVPSL погибали в течение 60 дней.

Для исследования роли Lgr5⁺-РСК в формировании метастазов инъекции DT начинали через две недели после имплантации, до появления метастазов. Проверка, проведенная еще через три недели, показала, что метастазы в печени оказались гораздо более мелкими, чем без введения DT.

В заключение авторы изучили роль Lgr5⁺-РСК в поддержании уже развившихся метастазов в печени. Это очень важная часть работы, так как для пациентов с подобными метастазами прогноз течения заболевания негативный, и эффективных лечебных средств нет, то есть вероятность их гибели велика. При введении мышам органоидов в портальную вену первичные опухоли не наблюдались, но развивались метастазы в печени (рис. 3). В то же время «лечение» DT резко подавляло рост метастазов. Даже через две недели после заключительной иньекции DT в печени наблюдались лишь отдельные мелкие метастазы.

Рис. 3. a — инъекция органоидов в портальную вену мыши с целью вызвать образование метастазов в печени без формирования первичной опухоли. b — схема этого исследования печени: после инъекции органоидов (Graft) ученые дожидались появления метастазов в печени (Liver mets), через 3 недели после инъекции начинали вводить дифтерийный токсин (DT on) в течение недели; затем через неделю и через две анализировали ткани печени. c–e — биолюминисценция и вид печени через неделю после окончания инъекций у  подопытных мышей (справа) и у контрольной группы, в которой вместо дифтерийного токсина вводили физраствор. Изображения из обсуждаемой статьи в Nature

Проведенная работа — это, по сути, детальный анализ участия Lgr5⁺-РСК в инициации и развитии злокачественных опухолей и метастазов. Она представляет собой первый случай, когда в поисках подходов к лечению рака авторы достигли «корней» рака — раковых стволовых клеток.

Вопреки ожиданиям, элиминация Lgr5⁺-РСК в первичных опухолях не приводит к их деградации. Опухоли проявляют пластичность, и какие-то другие клетки поддерживают их существование в отсутствие Lgr5⁺-РСК, хотя и не обеспечивают возможности расти. Если действие подавляющего агента прекращаеся, Lgr5⁺-РСК появляются вновь, и опухоль опять увеличивается в размерах. Эта ситуация сходна с ранее полученными данными по поддержанию гомеостаза кишечника при элиминации Lgr5⁺ клеток (J. Beumer, H. Clevers, 2016. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration). Возможно, деградацию опухоли можно будет вызвать комбинированным воздействием на Lgr5⁺-РСК и сигнальный путь Myc, который активируется при элиминации Lgr5⁺-РСК.

Наиболее интересными и важными представляются данные о ключевой роли Lgr5⁺-РСК в инициации, развитии и поддержании метастазов в печени при колоректальном раке. Полученные данные указывают на потенциальный новый способ лечения неизлечимых в настоящее время метастазов. В клинике для этого могут быть использованы, например, специфические антитела, направленные против Lgr5⁺ клеток. Результаты работы Мело и соавторов ставят ряд новых важных вопросов. Например, в какой мере роль Lgr5⁺-РСК при развитии опухолей и метастазов колоректального рака свойственна другим ракам? На него только предстоит получить ответ.

Источники:
1) F. S. Melo et al. A distinct role for Lgr5⁺ stem cells in primary and metastatic colon cancer // Nature. 2017. V. 543. P. 676–680. DOI: 10.1038/nature21713.
2) F. R. Greten. Cancer: Tumour stem-cell surprises // Nature. 2017. V. 543. P. 626–627. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)