Ассасину для успешного выполнения задания необходимо знать, как выглядит его цель. Его противник – вооружённая группа диверсантов, подавляющая боевой дух и оборонительные способности союзников. После нескольких минут разведки ассасин отправляется в атаку, молниеносно определяет, а затем бесшумно устраняет противника, практически не выдавая себя и не оставляя следов. Этот сценарий вполне может подойти для описания активности иммунных клеток против раковых клеток.
Наши ассасины – это экспериментальная разработка «молекулярной хирургии», которые получили название CAR-T cells (Chimeric Antigen Receptor-T). Они проходят обучение в специализированных лабораториях под контролем опытных врачей и ученых, снабжаются новейшим оружием. Их цель – распознать определенные молекулы на поверхности опухоли и ликвидировать малигнизированные клетки.
Сегодня речь пойдет об одном из наиболее перспективных направлений в терапии злокачественных новообразований – иммунотерапии, а конкретно – об адоптивной иммунотерапии на основе химерных Т-клеточных рецепторов (CAR), направленных к специфическим опухолевым антигенам. Адоптивная терапия основана на извлечении клеток иммунной системы из организма, затем их модификации с целью приобретения противоопухолевых свойств, последующего наращивания и реинфузии пациенту.
В начале необходимо упомянуть важную роль иммунной системы в противодействии или ликвидации формирования и прогрессии ранней неоплазии, опухолей на поздних стадиях и микрометастазов. Феномен спонтанной регрессии опухоли подтверждает этот тезис. Также о роли иммунной системы свидетельствует возрастание вероятности развития злокачественных опухолей при состояниях, сопровождающихся выраженной иммуносупрессией, в частности при пересадке органов.
Согласно устоявшейся теории иммунного контроля, клетки и ткани организма подвергаются мониторингу со стороны иммунной системы. Такой контроль ответственен за распознавание и элиминацию подавляющего большинства ранних опухолевых клеток и, как следствие, зарождающихся опухолей, однако опухоли в процессе развития приобретают многие черты, позволяющие им ускользать от иммунного надзора – этот процесс называется «Immunoediting» (иммуноредактирование). (изображение №1)
 |
Опухоль развивается из собственных клеток организма, и в связи с этим она не является иммунологически чужеродной (исключение – вирус-индуцированные опухоли). Опухолевые клетки не распознаются адаптивным иммунитетом (потому что происходит потеря опухолевого антигена или нарушается процесс презентации антигена) и становятся нечувствительным к иммунным эффекторным механизмам. К тому же опухолевое микроокружение – чрезвычайно хитрое изобретение рака, в котором происходит секреция иммуносупрессивных факторов, таких как IL-10, TGF, IL-6, Galectin-1, IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), VEGF, которые делают невозможным эффективное распознавание и уничтожение аномальных клеток иммунной системой. Также опухолевые клетки могут продуцировать молекулы PD-L1 и PD-L2 (иммунные контрольные точки), которые ингибируют деятельность Т клеток.
В результате опухолевой прогрессии происходит накопление мутаций в клетках опухоли, и появляются новые мутантные макромолекулы, являющиеся мишенями для компонентов иммунной системы. Поэтому ученые стараются дать новые возможности иммунным клеткам (в нашем случае это цитотоксические Т-лимфоциты) «пощупать» молекулярную структуру опухоли, оснастить их собственной «системой наведения», придать им устойчивость к иммуносупрессии для увеличения выживаемости, а после этого помочь проникнуть в строй раковых клеток.
СТРОЕНИЕ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА:
CAR T-клетки являются аутологичными цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые с помощью генной инженерии запрограммированы для экспрессии связывающего участка специфических антител: у Т-клеток появляется способность связывания специфического опухоль-ассоциированного антигена (TAA). В основном химерные антигенные рецепторы отражают в своей структуре нормальные Т-клеточные рецепторы, но имеют характерные отличия. (изображение №2)
CAR – рекомбинантный рецептор, состоящий из трех основных частей:
1) Внеклеточный домен (распознающая часть) – одноцепочечный вариабельный фрагмент необходимой специфичности, полученный от моноклонального антитела, у которого фрагменты легкой и тяжелой цепи связаны полипептидным линкером (single-chain variable fragment, scFv) – Targeting Domain. Его задача – распознавание опухоль-специфического антигена и образование антиген-связывающего участка. Цель такой модификации заключается в том, чтобы придать Т-клеточному рецептору способность распознавать поверхностные опухолевые антигены независимо от MHC, сохранять внутриклеточные сигнальные пути и функционал Т-лимфоцитов. К тому же они приобретают способность распознавать антигены небелковой природы, такие как углеводы, ганглиозиды, протеогликаны и др.
2) Шарнирный трансмембранный домен и спейсер (связывающий участок) – соединяют между собой внеклеточный и внутриклеточные домены и выполняют важную функцию – придают рецептору большую гибкость и повышают доступность для связывания, выводя антиген-распознающую часть рецептора за пределы гликокаликса Т-лимфоцитов. Как правило состоят из гомо- или гетеромебранных белков, таких как CD4, CD8, CD28, CD247. Различные спейсерные регионы могут приводить к заметным различиям в секреции цитокинов и цитотоксических свойствах Т-клеток. Кроме того, они могут влиять на взаимодействие между CAR-инженерными Т-лимфоцитами и другими элементами иммунной системы.
3) Внутриклеточный сигнальный и ко-стимулирующий домен (часть передающая сигнал) – состоит из нативного рецепторного комплекса Т-лимфоцитов (CD3-zeta) и одного или более ко-стимулирующих доменов, заимствованных у ко-стимуляторных рецепторов, как правило – CD28 или 4-1BB (CD137). Благодаря этому домену происходит активация Т-клеток, усиливается их пролиферация и выработка цитокинов, происходит возрастание их цитотоксической активности, повышается продукция антиапоптотических факторов для предотвращения гибели Т-клеток. (изображение №3)
 |
За все время существования химерных антигенных рецепторов, а это около 20 лет, ученые постоянно стараются их модифицировать. На сегодняшний день, существует уже 4 поколения CAR, и разрабатываются новые модели и концепции для их усовершенствования, такие как: “Armoured” CARs – секретируют провоспалительные цитокины, например, IL-12; двойные CAR, экспрессирующие опухоль специфический антиген и химерный цитокиновый рецептор 4-αβ; комбинированная терапия с блокаторами иммунных чекпоинтов; использование технологии CRISPR для создания CAR и многое другое. (изображение №4)
Все конструкции CAR, используемые в настоящее время в клинических испытаниях (1 и 2 фазы), представляют собой CAR второго поколения, состоящие из CD28 или 4-1BB (CD137), но сразу же хочется отметить, что CAR Т-клетки – это не чудодейственное лекарство от рака. Несмотря на ремиссию некоторых видов опухолей, у группы пациентов отмечаются побочные эффекты, зафиксированы случаи летального исхода в ходе клинических испытаний.
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ CAR T-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ:
1) CAR T-клетка распознает и связывается с таргетным антигеном на опухолевых клетках.
2) Связывание индуцирует конформационное изменение, которое передает сигнал через клеточную мембрану Т-лимфоцита внутрь клетки.
3) Внутри клетки рецепторы второго поколения доставляют как первичный сигнал активации через CD3-zeta, так и ко-стимулирующий сигнал через CD28 или 4-1BB домены.
4) Активированные цитотоксические CAR Т-клетки образуют иммунологический синапс, который в последствии перестройки принимает вид микрополости, через которую секретируются клетки секреторных лизосом, содержащих молекулы перфорина и гранзимов. Перфорин является аналогом компонента комплемента С9.
Затем происходит полимеризация молекул перфорина и через данную структура проникают молекулы гранзимов и гранулизинов. Основная роль гранзимов при проникновении в клетку заключается в активации каспаз, в частности каспазы 3, запускающей апоптоз (альтернативный путь – митохондриальный апоптоз). Другой путь индукции апоптоза клетки-мишени является FAS-лиганд (белок суперсемейства белков факторов некроза опухоли) зависимый механизм, который также инициирует каспазный каскад, приводящий к протеолизу многих жизненно важных белков клетки и запуску апоптоза. Также происходит выделение интерлейкина-2 (IL-2), которое может способствовать выживанию Т-клеток. Интерферон (IFN)-гамма может активировать врожденный иммунный ответ. (изображение №5)
ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА CAR Т-КЛЕТОК:
1) Как правило, лейкоциты от пациента собираются с помощью лейкофереза
Ключевым параметром, необходимым для производства терапевтического клеточного продукта, служит сбор достаточного количества Т-лимфоцитов, ориентировочно около 100 × 10^6 клеток, поэтому сбор желательно проводить до проведения курсов химиотерапии.
2) Необходимый фенотип Т-клеток отбирается с помощью процедуры проточного центрифугирования с элютриацией.
3) Полученные лимфоциты перемещаются в культуру и активируются с помощью синтетического поликлонального активатора, связывающегося с рецепторами CD3 и CD28;
4) Производится доставка вирусного вектора. Наиболее часто для этой цели используют ретровирусные векторы, в том числе полученные из гамма-ретровирусов и лентивирусов. Это небольшие, РНК-содержащие вирусы. Путем обратной транскрипции происходит встраивание вектора и переносимого генетического материала непосредственно в геном клетки-мишени, что обеспечивает их постоянную экспрессию.
5) Экспансия клеточной культуры в биореакторе в течение нескольких дней под действием цитокинов, поддерживающих пролиферацию Т-лимфоцитов, - IL-2, IL-7, IL-15.
6) Полученный Т-клеточный продукт промывается и концентрируется.
7) Пробы отправляются на контроль качества клеточного продукта – тестирование на микробиологическую безопасность, эффективность трансдукции и функциональную активность Т-лимфоцитов.
8) Клеточный продукт криоконсервируется для удобства транспортировки.
9) Готовый Т-клеточный продукт размораживают и производят инфузию пациенту. (изображение №6)
 |
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ТЕРАПИИ CAR T-КЛЕТКАМИ:
По данным National Institutes of Health сейчас в мире проводится около 150 клинических испытаний новых CAR к поверхностным антигенам опухолей. Основная часть исследований посвящена лимфопролиферативным заболеваниям, однако примерно 30% работ сфокусировано на солидных опухолях (нейробластома, рак молочной железы, рак легкого и др.). Еще больше исследований находятся на доклинической стадии, и публикуемые результаты позволяют рассчитывать на значительный прогресс в этом, ещё новом, направлении противоопухолевой терапии. Почти идеальным антигеном-мишенью является CD19, представляющий собой линейно-специфичный тканевой антиген, экспрессированный практически на всех этапах дифференцировки В-лимфоцитов, за исключением плазматических и стволовых гемопоэтических клеток. CD19 экспрессируется на поверхности опухолевых клеток почти всех В-линейных опухолей (острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, В-клеточные неходжкинские лимфомы). К тому же, антитела против СD19 ингибируют рост опухолевых клеток. Именно с использованием СD19-CAR Т-клеток (=CTL019) были получены первые успешные результаты терапии.
В январе 2016, Пенсильванский Университет и Детская больница города Филадельфия, при поддержке «Novartis Pharmaceuticals», провели клинические испытания препарата CTL019 (СD19-CAR Т-клетки трандуцированные лентивирусом и содержащиие 4-1BB костимуляторные домены), в ходе испытаний более чем 200 пациентов, подверженных ОЛЛ, ХЛЛ, неходжкинсокой лимфоме, прошли курс терапии. Согласно последним данным в области исследований CTL019, представленным Europian Hematology Association, 45 из 48 пациентов педиатрического отделения (94%) достигли терапевтического ответа, выживаемость без прогрессирования 76% при медиане наблюдения 6 месяцев. У 13 пациентов в течении года произошла ремиссия и было отмечено несколько случаев синдрома «цитокинового шторма».
В другом исследовании 14 пациентов с резистентным / рецидивирующим течением хронического лимфолейкоза получили терапию CD19 CAR T-клетками с 4-1BBz костимулирующим доменом в дозе от 0,14 × 108 до 11 × 108 CTL019 клеток. Полный ответ был получен в 29% случаев, частота суммарного объективного ответа (objective response rate, ORR) составила 57%. В этой группе пациентов была обнаружена длительная персистенция терапевтических клеток (до 4 лет). К слову, длительная персистенция Т-лимфоцитов оказывает неблагоприятное воздействие на организм пациента, в частности из-за синдрома «цитокинового шторма», поэтому ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско создали молекулярный «выключатель», с помощью которого можно управлять действиями генноинженерных Т-лимфоцитов. Одним из способов такого «выключения» служит трансдукция Т-лимфоцитов так называемыми суицидальными генами (suicidal genes), продукты которых, под действием специфических малых молекул, запускают апоптоз Т-лимфоцитов.
Одним из важных наблюдений стала потеря экспрессии CD19 опухолевыми клетками при развитии рецидива острого лимфобастного лейкоза после терапии. Заключения всех исследовательских групп подтвердили: этот механизм является ведущим в развитии рецидива при терапии CAR Т-клетками. В этой связи, одним из возможных решений является одновременное таргетирование нескольких антигенов на поверхности опухоли, что теоретически должно снизить риск «ускользания» опухоли от эффекторных механизмов иммунной системы. В настоящее время ученые занимаются поиском новых антиген-мишеней, которые продуцируют опухоли, вот некоторые из них:
А) Таргеты для CAR Т-клеточной терапии гематологических новообразований проходят клинические испытания, которые включают CD20, CD22, ROR1, IgΚ, BCMA, CD138, CD33, CD123 и LewisY antigen.
Б) Таргеты для CAR Т-клеточной терапии солидных форм опухолей включают PSMA, FAP, CEA, CD171, GD2, glypican‑3, HER2 и IL‑13Rα.
Несмотря на интересные результаты в клинических исследованиях, терапия CAR T-клетками пока что еще не одобрена. В общей сумме было проведено огромное количество клинических испытаний для терапии различных типов опухоли, но существующие платформы, безусловно, нуждаются в совершенствовании с точки зрения как безопасности, так и эффективности терапии. (изображение №7)
НЕДОСТАТКИ И ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ ТЕРАПИИ CAR T-КЛЕТКАМИ:
1) В-лимфопения, обусловленная закономерной деплецией пула нормальных В-лимфоцитов – не угрожающее для жизни пациента состояние, которое может быть скорректировано клиническими инструментами.
2) Синдром «цитокинового шторма» (CRS – cytokine release syndrome) – на сегодняшний день наиболее тяжелое осложнение терапии CAR T-клетками. Отличительной чертой CRS является повышение иммунного ответа, который приводит к значительному увеличению воспалительных цитокинов. Клинические и лабораторные показатели CRS варьируются от умеренной до тяжелой CRS (потенциально жизнеугрожающие состояния). Клинические проявления включают в себя: повышение температуры, усталость, миалгию, тошноту, анорексию, тахикардию, гипотонию, капиллярные кровотечения, сердечная дисфункцию, почечную и печеночную недостаточность, эритематозную, зудящую сыпь. В основном увеличивается концентрация таких цитокинов, как: INF-gamma, гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор, IL-10, IL-6.
3) Нейротоксичность, проявляющаяся спутанностью сознания, делирием, афазией, миоклонусом, судорогами, галлюцинациями. Механизмы данного осложнения не установлены.
4) Возможность возникновения реакции «трансплантат против хозяина», так как химерные Т-лимфоциты не являются строго специфичными для опухолевой ткани. (изображение №8)
 |
Я надеюсь, что в ближайшем будущем мы сможем создать армию из собственных иммунных клеток и направить ее для уничтожения противника. Успехи в иммунотерапии онкологических заболеваний провозгласят новую эпоху в медицине. Война, объявленная раку в 1971 году Ричардом Никсоном, продолжается и по сегодняшний день.