Микробиом, а в частности — микробиом кишечника — стал в последнее время актуальной темой биомедицинских исследований, чему способствует непрерывное развитие аналитических методов.. Оригинальные эксперименты на моделях животных показали влияние микробиоты кишечника на здоровье, а так же то, как нарушение ее состава может способствовать патогенетическим процессам заболевания. Неудивительно, что связь между микробиотой и заболеваниями у людей — предмет значительного интереса. Однако, за редким исключением, инкриминирование измененной микробиоте участия в патогенезе заболевания представляется преждевременным, учитывая неполное понимание нами состава “здоровой” кишечной микробиоты и влияния множества конфаундеров на интерпретацию предположительно аномальных микробных сигнатур. Будущие исследования должны учитывать эти переменные и двунаправленность взаимодействий хозяин-микроорганизм у здоровых и больных. В статье будет рассмотрена перспектива использования данных об индивидуальной микробиоте в клинике, например, для облегчения диагностики или уточнения прогноза а также дан прогноз относительно будущих достижений.
Не многие области биомедицины могут похвастаться таким быстрым прорывом в знаниях, как те, что связаны с микробиомной революцией — изучением микробиома кишечника [1]. За последние два десятилетия мы многое узнали о роли наших бактерий-комменсалов в поддержании здоровья. Неудивительно, что клинические и лабораторные исследования были устремлены на изучение связей между микробиомом кишечника и различными заболеваниями. Первоначально, по очевидным причинам, основное внимание уделялось заболеваниям желудочно-кишечного тракта, где уже были отмечены примеры воздействия аномальной микробиоты кишечника — кишечным инфекциям, Helicobacter pylori-опосредованным заболеваниям и антибиотик-ассоциированной диарее [2]. За последнее десятилетие, благодаря быстрым и постоянно развивающимся успехам в методах, позволяющих подсчитать кишечные бактерии, их гены и продукты метаболизма [3], мы получили доказательства, подтверждающие связь кишечной микробиоты с широким спектром психоневрологических, иммунологических и аллергических заболеваний [4]. К примеру, измененная микробиота была, видимо, вовлечена в множество разнообразных расстройств, от болезни Паркинсона [5] и аутизма [6] до диабета [7], астмы [8] и целиакии [9].
Таким образом, за очень короткий промежуток времени исследования микробиома сместились от лаборатории к клинической практике, где их потенциал в облегчении диагностики, определении прогноза и лечебной тактики вызвал интерес среди исследователей и биомедицинской индустрии. В основе веры в клиническую применимость микробиома лежат три предположения: во-первых, мы знаем, каков он в норме; во-вторых, мы можем точно и воспроизводимо определить патологию; и, в-третьих, возможно, самое важное: мы можем установить биологически достоверные и клинически значимые взаимоотношения между определенным микробным профилем и рассматриваемым заболеванием.
Для объяснения своей позиции, мы будем использовать следующие определения. Понятие “микробиота” относится к совокупности микроорганизмов (а не только бактерий), присутствующих в определенной среде. Микробиом, напротив, включает в себя полный набор микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибков и простейших), их генов и геномов в данной локации (например, в кишечнике). Стоит признать, что часто в литературе эти термины используются как взаимозаменяемые, обозначая микробные сообщества.
Что является нормой?
Несмотря на достижения в аналитических технологиях и их интерпретации, наше понимание состава и функции всех бактериальных популяций (не говоря о таких микроорганизмах, как вирусы и простейшие), обитающих в различных отделах желудочно-кишечного тракта, остается неполным [3]. Было подвергнуто сомнению даже часто упоминаемое соотношение бактериальных клеток к человеческим 10:1 [10]. Хотя мы многое узнали о роли микробиоты в поддержании здоровья [11], этот прогресс не позволяет нам четко определить понятие “нормы”. Несмотря на то, что довольно крупные популяционные исследования (от нескольких сотен до более чем тысячи участников) продемонстрировали некоторую общность между здоровыми людьми на родовом уровне, для видов и штаммов характерны индивидуальные вариации [12-15]. Поскольку определены факторы, способствующие этой изменчивости, можно оценить, в какой степени такие параметры, как возраст [16, 17], характер родоразрешения [18], грудное или искусственное вскармливание [19], питание [20], географическое расположение [18], физическая нагрузка [21], употребление алкоголя [22] или антибиотиков [23], могут повлиять на любое понимание “нормы” (Рис. 1). На сегодняшний день диета вполне может быть главным конфаундером многих исследований микробиома человека. Для микробиоты важен не только общий характер модели диеты (например, веганы в сравнении с вегетарианцами и в сравнении с “мясоедами” или подвергнутая глубокой обработке западная пища в сравнении с сельской африканской), но и относительные количества конкретных компонентов (углеводы, белки, жиры, клетчатка) [24]. Привычная диета может надолго обеспечить формирование микробиоты [20, 24-27], но кратковременные изменения в рационе, в том случае, если они будут достаточно существенными, как это может иметь место у людей с желудочно-кишечными заболеваниями, также могут повлиять на изменения бактериального разнообразия [28-30]. Влияние грудного молока, опосредованное его собственной бактериальной популяцией, а также олигосахаридами-пребиотиками, на микробиоту новорожденных и старших детей представляет собой еще один яркий пример воздействия факторов окружающей среды [19, 31, 32]. Вносить изменения могут и другие терапевтические агенты. Антибиотики — очевидные источники проблем, хорошо описан эффект их различных терапевтических доз [33]. Менее регистрируемые, но потенциально гораздо более влияющие на микробиом кишечника изменения оказывают дозы антибиотиков,используемых в животноводстве, которые мы получаем с пищей, что описано на экспериментальных моделях животных [34]. Поскольку с каждым днем все подробнее описываются изменения микробиоты кишечника, связанные с применением других лекарственных средств, нам следует подготовиться к неожиданностям [35, 36].
 |
|
Рисунок 1 | Факторы, которые влияют на состав и функции микробиоты кишечника человека.
На кишечную микрофлору влияет множество факторов. По часовой стрелке с левого верхнего угла: способ родоразрешения; естественное или искусственное вскармливание; питание; физические упражнения и другие индивидуальные привычки; наличие заболевания; возраст; прием медикаментов (в основном антибиотики, но также антациды и метформин); регион проживания.
|
Накапливаются доказательства того, что модификации микробиома кишечника во младенчестве и раннем детском возрасте могут привести к развитию заболеваний в дальнейшем [34, 37]. Поэтому попытки модуляции микробиома с целью улучшения состояния здоровья у взрослых, скорее всего, обречены на провал. Конечным смещающим фактором и камнем преткновения является тот факт, что во многих исследованиях изменения, наблюдаемые в микробиоме кишечника, могут быть следствием изучаемого заболевания, а не его причиной. Во-первых, микробиота кишечника находится под влиянием генома хозяина [38] и генетические особенности, предрасполагающие к заболеванию, могут в той же мере определять индивидуальный состав микробиоты. Во-вторых, воспаление само по себе, за счет эффектов медиаторов воспаления, может нарушить бактериальное разнообразие [39]. Также следует помнить о том, что ось микробиота-кишечник-мозг на настоящий момент двунаправленная, о чем свидетельствуют эффекты, которые оказывает стресс на физиологию кишечника, иммунитет и состав кишечной микробиоты [40] (Рис. 2).
Роль микробиоты в желудочно-кишечных заболеваниях
Понимание контекста
В экспериментах, где участвовали различные in vitro, in vivo и ex vivo модели, изучали роль микробиома в здоровом гомеостазе, а также же в патофизиологии воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) и синдрома раздраженного кишечника (СРК) [41-46]. На фундаментальном уровне многие из этих расстройств, видимо, связаны с переменным взаимодействием между нормальной и патологической микробиотой кишечника, продуктами микробного метаболизма, геномом хозяина (регулирующим такие факторы, как иммунный ответ), кишечным барьером (в широком смысле) [47], иммунным ответом организма хозяина, его физиологией, а также с диетой и другими факторами микро- и макроокружения. Учитывая, что многие из
этих взаимодействий двунаправлены, не сложно оценить, с какими трудностями сталкивается исследователь, пытаясь выделить роль микробиоты кишечника в возникновении изучаемого заболевания.
Был достигнут определенный прогресс. Защитную роль интактной микробиоты кишечника и эффекты, развивающиеся при ее грубом повреждении наглядно демонстрирует развитие инфекции Clostridium difficile на фоне супрессивной терапии антибиотиками широкого спектра действия [48]. Была описана микробная сигнатура, предрасполагающая индивида к этой потенциально опасной для жизни инфекции [49], а также in vivo было показано, что фекальная микробная трансплантация (ФМТ) восстанавливает устойчивость к инфекции C. difficile [50].
Показано, что характер взаимодействия между факторами патогенности бактерий, геномом хозяина и его иммунным ответом влияет на формирование фенотипа заболеваний, возникающих при инфицировании Helicobacter pylori [51]. Хотя конечный фенотип ВЗК довольно гетерогенный, предполагается, что ключевую роль в патогенезе играет схожий механизм взаимодействия бактерий и иммунного ответа хозяина, о чем свидетельствует распространенность полиморфизмов преимущественно в генах (таких как NOD2/CARD15), участвующих в реакции иммунного ответа организма на бактерии среди всего множества генов, которые связаны как с болезнью Крона, так и с язвенным колитом [52]. Схожие одиночные нуклеотидные полиморфизмы были определены в генах, кодирующих Toll-like рецептор 9, IL-6 и E-кадгерин (CDH1) в одном из подтипов СРК — постинфекционном СРК, что предполагает вовлечение в патогенез аномального иммунного ответа, а также нарушение барьерной функции кишечника [53].
В крайне упрощенном понимании, нарушению барьерной функции кишечника часто инкриминируется патогенез индуцированных (или опосредованных) микробиотой гастроинтестинальных и системных расстройств. В соответствии с этой моделью (Рисунок 3), так называемое нарушение “герметичности кишки” способствует транслокации бактерий или продуктов их жизнедеятельности (например, липополисахаридов Грам-отрицательных бактерий) через поврежденный эпителий в портальный или системный кровоток, что приводит к сепсису или системному иммунному ответу [54]. Несмотря на привлекательность этой гипотезы, она имеет некоторые несоответствия. Во-первых, в отличие от животных моделей, методы выявления бактериальной транслокации у людей оказались ненадежными и имели различную воспроизводимость [55]. Во-вторых, применяемые методики исследования проницаемости кишечника у людей, например, оценка соотношения лактулозы к маннитолу, относительная абсорбция полиэтиленгликолей различной молекулярной массы или клиренса 51CrЭДТА [56], разработаны для оценки целостности парацеллюлярного ионного и водного транспорта, который едва ли способен транспортировать крупные молекулы метаболитов бактерий, не говоря уже о самих бактериях (размер пор 7.5 Å (0,00075 мкм) в сравнении с размерами E. coli, 0,5х2 мкм) [57, 58]. Но это не означает, что обнаружение нарушений парацеллюлярной герметичности не может служить косвенным признаком повреждения эпителия, в результате которого могут нарушаться межклеточные и другие пути, способствуя транслокации бактерий и/или их продуктов. Наконец, ключом к системной диссеминации кишечных бактерий могут стать такие компоненты защитных структур кишечника, как гемато-энтеральный барьер [59].
Некоторые продукты метаболизма бактерий играют решающие роли в патогенезе симптомов и даже в этиологии кишечных и системных заболеваний. Желчные кислоты обладают сложной и двунаправленной связью с кишечной микрофлорой. С одной стороны, желчные кислоты оказывают бактериостатическое влияние на некоторые микроорганизмы, а потому лактобациллы и бифидобактерии [60] приспособились уклоняться от их воздействия с помощью фермента гидролазы желчных кислот. С другой стороны, переработка бактериями первичных желчных кислот приводит к образованию продуктов, которые, благодаря непрерывно растущему многообразию регуляторных функций, могут оказывать влияние на метаболизм хозяина и иммунный ответ [61], а также на моторику и секреторную активность толстой кишки. Например, показано, что хенодезоксихолевая кислота ускоряет транспорт в толстой кишке [62], тауродезоксихолевая модулирует активность апикального обмена хлорида и гидроксида в эпителии тонкого кишечника [63], а также, выступая в качестве эндогенных агонистов связанного с клеточной мембраной рецепторного G-белка TGR-5, а такие желчные кислоты, как холевая, хенодезоксихолевая и дезоксихолевая способствуют экспрессии глюкагон-подобного пептида-1, тем самым усиливая секрецию инсулина и йодтиронин деионидазы 2 типа (главный белок термогенеза) [64]. Активация TGR-5 посредством воздействия на экспрессию медиаторов, высвобождаемых в ответ на активацию пути NF-kB и супрессию пути, активирующего Toll-like рецептор 4, может оказывать противовоспалительное действие [64]. Кроме того, короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) являются важным продуктом бактериального метаболизма непереваренных углеводов [65]. Долгое время КЦЖК считались важным субстратом поддерживающим активность в толстой кишке, но все больше признаются такие их эффекты, как модуляция иммунитета и нейроэндокринный сигналинг [66].
 |
|
Рисунок 2 | Ось микробиом-кишечник-мозг
Между микробиотой кишечника, кишечником (включая его иммунную и нервную системы, а также барьерную функцию) и мозгом происходит двунаправленное взаимодействие. ЦНС — центральная нервная система.
|
Интерпретация исследований
Из вышеприведенного обзора относящихся к микрофлоре кишечника патогенетических и патофизиологических факторов следует, что при конкретном желудочно-кишечном заболевании возможны их множественные взаимодействия. Определение относительной значимости эффектов этих взаимодействий хотя и возможно на биологических моделях, все еще трудновоспроизводимо или вовсе не осуществимо у людей. Выявление наличия микроорганизмов с помощью высокопроизводительного секвенирования, несомненно, хороший первый шаг, но лишь показывает наличие связи, не раскрывая ее причину. Более полное определение патогенетической роли конкретной микробной сигнатуры может быть обеспечено с помощью метагеномики и дополнено метаболомикой. Критическим отличием будущих исследований микробиоты у здоровых и больных должно стать большое внимание к функциям компонентов микробиоты, а не только к их описанию (Вставка 1). Изучение Найфэчем и Поллардом [67] бактериального метагенома с использованием шотган-секвенирования имеет потенциал для идентификации метаболических путей бактерий, микробных взаимодействий и метаболитов бактерий, воздействующих на организм хозяина. Метаболомика, использующая методы масс-спектрометрии и ядерной магнитно-резонансной спектроскопии, позволяет идентифицировать молекулы, которые продуцирует микробиота кишечника и помогает в определении их метаболических путей [68]. Другие “-омики”, такие как метатранскриптомика и метапротеомика обладают потенциалом для дальнейшего выявления функций микробиома кишечника. Потенциал детального изучения бактериальных геномов в сочетании с манипулированием генами проиллюстрирован в ходе последних исследований особого штамма Bifidobacterium longum spp. [69, 70]. Выявив кластер генов, ответственный за создание экзополисахаридного (ЭПС) слоя, обволакивающего клетки бактерии [56], и разработав мутанта, лишенного этих генов, исследователи смогли определить ключевую роль, которую ЭПС сыграл в иммуномодулирующей функции этих бактерий [70]. Изучение роли микробиоты кишечника при печеночной энцефалопатии (возможно первичное нарушение микробиомно-кишечной оси) [71] иллюстрирует недостатки подходов, ограниченных только высокопроизводительным секвенированием. В ходе исследования закономерностей положительных эффектов плохо всасывающегося в кишечнике антибиотика рифаксимина на течение печеночной энцефалопатии, было обнаружено, что улучшение состояния при применении этого препарата было обусловлено скорее сдвигами в метаболизме бактерий, чем изменениями в фактическом составе кишечной микробиоты [72]. Также заслуживают внимания бактериологические исследования: не только при определении жизнеспособности бактериальной культуры, но и как дополнение к генетическим методам идентификации и характеристики видов бактерий [73].
 |
|
Рисунок 3 | Гипотеза “негерметичности” кишечника
а | Нормальный кишечник (интактный барьер, имеющий плотные контакты) предотвращает транслокацию бактерий и/или бактериальных компонентов или продуктов в подслизистый слой. b | “Негерметичный” кишечник: нарушение целостности плотных контактов позволяет бактериям (от нормальной до патологической микрофлоры кишечника) проникнуть в подслизистую оболочку, где они активируют тучные клетки и лимфоциты, которые высвобождают протеазы, цитокины и хемокины, которые приводят к воспалению и активации чувствительных нейронов. Также становится доступной сосудистая сеть, а именно портальная, печеночная и, потенциально, системная циркуляция. Как обсуждалось выше, эта гипотеза представляет собой упрощенное объяснение взаимодействия мозга и кишечного барьера, а многие из вышеупомянутых этапов не определялись у людей.
|
Перед клиническим исследователем стоят и другие проблемы. О влияниях взаимодействий между микробиотой и компонентами питания или продуктами метаболизма, о которых уже упоминалось ранее, следует помнить как в области трансляционных, так и клинических исследований. К примеру, изучая ВЗК, следует учитывать как каждая из многих диет, используемых пациентами, может влиять на микробиом [28, 30, 74]: от диеты с высоким содержанием пищевых волокон до безглютеновой или диеты с низким содержанием ферментируемых олигосахаридов, дисахаридов, моносахаридов и полиолов.
Свои трудности имеются и в отборе проб, а также в обработке, хранении и анализе биологических образцов. По вполне понятным причинам, большинство исследований кишечного микробиома человека основано на анализах образцов кала. Этот подход игнорирует громадные различия в плотности и популяциях бактерий на протяженности желудочно-кишечного тракта. Поэтому вряд ли заболевание тонкого кишечника, опосредованное изменениями микробиома, будет обнаружено с помощью образца кала, так как изменения в небольших бактериальных популяций кишечника не обнаруживаются на фоне огромной популяции микроорганизмов толстой кишки. Кроме того, в любом месте кишечника присутствуют очевидные различия между бактериальными популяциями, локализующимися пристеночно или в просвете [75]. Серьезным ограничением этого подхода является и то, что штаммы таких ассоциированных со слизистой бактерий не будут в полной мере представлены в образцах кала. Разумеется, разновидности бактерий, обитающих на поверхности слизистой или в слое слизи, более склонных к взаимодействиям с иммунной системой хозяина и кишечным барьером, тогда как расположенные в просвете больше влияют на метаболические взаимодействия с продуктами, участвующими в процессе пищеварения. Уже существуют доказательства наличия четких различий между этими популяциями как у здоровых, так и у больных [76-78]. Например, Кодлинг и коллеги отметили гораздо меньшую вариабельность бактериальных сигнатур слизистой в сравнении с таковой в просвете у одних и тех же индивидов. Из экономических соображений при масштабных исследованиях образцы обычно замораживаются, а затем анализируются партиями. Способы обработки и хранения образцов, а также методология, используемая для их анализа, также влияют на результаты [3].
Долговременные исследования со сбором образцов кишечной микробиоты в нескольких временных интервалах, отслеживающие активность заболевания или интенсивность симптомов, могут помочь в определении причинно-следственной связи (редкость в исследованиях на людях). В конечном счете, роль микробиома в данном заболевании должно отразить лечение, направленное на его модификацию. К настоящему времени этому критерию отвечает только инфекция, вызванная Clostridium difficile [79].
Заключение
Свершившаяся благодаря многочисленным исследованиям микробиомная революция бросила вызов своей элегантной характеристикой сложных и крупных ролей микробиома в гомеостазе, а также в патофизиологии заболеваний на животных моделях. Между тем, наличие техник высокопроизводительного секвенирования породило многообразие исследований роли кишечной микробиоты почти во всех известных заболеваниях ЖКТ, печени, поджелудочной железы и желчного пузыря. До настоящего времени результаты были в лучшем случае запутаны, а в худшем противоречивы, но это не удерживало от поспешных обвинений “аномальных” бактериальных сигнатур в развитии многих из этих заболеваний. Тем не менее, формированию четкой картины роли кишечной микробиоты в распространенных заболеваниях желудочно-кишечного тракта мешают неспособность учитывать конфаундеры и оптимизировать методы отбора проб. Зная об этих ограничениях и вооружившись арсеналом разнообразных микробиологических методов, в настоящее время мы можем проводить приведенные в надлежащее состояние продольные исследования популяций с измененным фенотипом, используя стандартизированную методологию [86], которая имеет потенциал в раскрытии ролей наших бактериальных попутчиков в заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Такие исследования являются необходимой прелюдией к разработке новых диагностических и терапевтических вмешательств. Пока они не будут завершены, мы не можем и не должны предлагать анализ микробиоты, как диагностический или прогностический инструмент рутинной клинической практики.