Сводка с генотерапевтических фронтов. Новая стратегия нейтрализации гемофилии.

Калифорнийские ученые разработали беспромоторную и безнуклеазную стратегию компенсации мутаций гена свертывающего фактора IX, тем самым избавив от повышенной кровоточивости разновозрастных мышей. Остроумный способ конструирования и введения терапевтического вектора предполагает наименьшее количество возможных побочных эффектов этиологического лечения не только гемофилии B, но и других наследственных заболеваний.

Генная терапия — вызов, брошенный человечеством природе, мудрой в целом, но иногда очень несправедливой по отношению к индивиду. Борьба врачей, биологов, физиков и химиков с генетическими дефектами, выливающимися в тяжелые хронические заболевания, начинает приобретать характер войны. Наступление ведется по нескольким фронтам одновременно. И даже конкуренция стратегий идет на пользу общему делу — каждая группа исследователей выискивает недостатки чужих разработок, учитывает их в планировании своих, заимствует у коллег самое остроумное и надежное. Ведь крайне желательно, чтобы как можно меньше мирного населения («подопытных») полегло на этих фронтах: проводятся сотни клинических испытаний разных генотерапевтических подходов, в некоторых наблюдается достойный компенсирующий эффект, однако даже в минимальных выборках встречаются побочные эффекты (особенно часто — канцерогенез).

Возможно, придётся находить баланс между рисками исходного заболевания и побочных эффектов. Например, на чашах весов могут расположиться гемофилия и сбой в работе печени, который можно быстро компенсировать. С другой стороны, технологии развиваются в очень конкурентной среде, и генноинженерные группы разными путями приближаются к «Святому Граалю» — замене дефектного гена на нормальный. Путь должен быть максимально прост (и дёшев), а «вылеченный» генόм не должен содержать ничего лишнего. Идея-то проста, а вот реализовать ее в живом организме сложно. Оригинальную стратегию предложила калифорнийская группа с «костяком» из сотрудников Стэнфордского университета, включая Ади Барцеля и Марка Кея, недавно основавших биотехнологическую компанию LogicBio Therapeutics [1]. Их задача-минимум заключалась в преодолении генетически обусловленного дефицита фактора свертываемости крови IX у страдающих гемофилией B мышей (см. справку по гемофилии), а задача-максимум — сделать это без ущерба для грызунов, ведь на их месте скоро будут люди.

Справочная информация по гемофилии

 

Рисунок 1. Королева Виктория с внучками, принцессами Викторией, Елизаветой и Алисой Гессенскими. Младшая, Алиса, — будущая императрица Александра Федоровна, передавшая «бабушкино наследство» сыну Алексею. Фото 1879 г.

Гемофилия — наследственная (X-сцепленная, рецессивная) патология свертывающей системы крови [2,3], одна из форм геморрагического диатеза — состояния повышенной кровоточивости (термин распространен в англоязычной литературе по гемофилии и не связан с аллергической сыпью на детских щеках). Как самостоятельное заболевание гемофилию описал в 1803 году J.C. Otto, а термин в 1828 году ввел F. Hopff, однако в России болезнь чаще называли просто «царской» — ведь ею страдал сын Николая II, цесаревич Алексей. Такое незавидное наследство досталось ему от британской королевы Виктории (рис. 1). И не ему одному: мутантная «викторианская» X-хромосома уверенно обосновалась в нескольких королевских домах Европы — среди потомков Виктории выявлено 6 женщин-носительниц и 11 мужчин-гемофиликов. До взрослого состояния в начале XX века доживало около 20% больных, ведь ничего радикального тогдашняя медицина предложить не могла. В отличие от «целителей». Один из докторов, лечивших Алексея Романова, Е.С. Боткин, говорил, что если бы не существовало Распутина, его все равно бы выдумали из кого-нибудь [4]. Разумеется, от преждевременной смерти они, целители, никого не спасали — гены-то не заговоришь.

В многостадийном процессе свертывания крови участвует 13 плазменных факторов, обозначаемых римскими цифрами. Дефицит либо отсутствие факторов VIII или IX вызывает развитие гемофилии А («классической») или В (болезни Кристмаса) соответственно. Существуют и коагулопатии, связанные с дефектами других свертывающих факторов, однако они отличаются и по симптоматике, и по механизму наследования от гемофилий A и B.

Поскольку гены факторов VIII и IX локализованы в X-хромосоме, то мальчики болеют (дефект материнской хромосомы не компенсирован нормальным аллелем), а девочки чаще всего только передают мутантный аллель следующим поколениям (дефект частично компенсирован второй X-хромосомой), но изредка тоже болеют (когда больному мужчине и женщине-носителю «посчастливится» найти друг друга и сотворить «гомозиготу»). Гемофилия А наблюдается особенно часто — у одного из 4–5 тысяч новорожденных мальчиков, в то время как гемофилия В — у одного из 20–30 тысяч. В настоящее время известно 1 095 полиморфизмов гена F9, ассоциированных с гемофилией В. «Дурную наследственность» удается выявить в 70–90% случаев гемофилии, описаны и мутации de novo.

Спектр дефектов генов F8 и F9 чрезвычайно широк: потери целых генов или делеции их фрагментов, инверсии интронов, инсерции, дупликации, сплайсинг-, нонсенс- и миссенс-мутации. В зависимости от типа мутации развивается заболевание определенной тяжести.

Для гемофилий A и B характерен отсроченный геморрагический синдром, обусловленный нарушением первой фазы свертывания крови — образования активного плазменного тромбопластина. При минимальных травмах или даже спонтанно возникают болезненные кровоизлеяния: в мягкие ткани (подкожные, внутримышечные, в забрюшинное пространство, стенки кишечника и др.), в кости и суставы (инвалидизирующие гемартрозы), мозг [5]. Носовые или связанные с удалением зубов кровотечения иногда не удаётся остановить несколько часов.

Профилактика травм и заместительная терапия — все, чем на сегодняшний день располагает больной гемофилией. Замещение недостающего фактора свертывания производится в целях профилактики и купирования кровотечений свежезамороженной плазмой и концентратами человеческих (или полученных из животных) факторов VIII и IX. Но: факторы быстро выводятся из организма, существует риск переноса хронических вирусных инфекций, как и риск выработки ингибиторов — антител, нейтрализующих вводимый антигемофильный фактор. Тогда назначаются антиингибиторные комплексы, плазмаферез и даже иммунодепрессанты.

Недавно начаты клинические испытания некоторых генотерапевтических подходов, однако ни один из них пока не признан безоговорочно безопасным даже теоретически.

Как перенести терапевтический ген в нужные клетки и обеспечить его поддержание?

В первую очередь калифорнийской команде пришлось поразмыслить именно над этим вопросом. Обычно клонированный терапевтический ген находится в векторе в составе экспрессионной кассеты, содержащей подходящие регуляторные элементы. После введения в клетку все это добро может встроиться в хромосому (специфично или нет) либо жить себе отдельно в виде эписомы. Наиболее эффективными «проводниками» чужеродной ДНК в эукариотические клетки — векторами — считаются предварительно «выпотрошенные» вирусы [6], у которых из родного генома остаются лишь необходимые для трансдукции фрагменты. То есть эти дефективные агенты инфицируют клетку, но не могут ее разрушить и заразить соседние. Чаще всего в генотерапевтических экспериментах участвуют ретровирусы (в том числе лентивирусы) и аденовирусы. Однако выбор Ади Барцеля и его коллег пал на стремительно набирающих популярность «малых, да удалых» аденоассоциированных вирусов [7]. Почему?

На выбор вектора прежде всего влияют тип «целевой» ткани и активность деления ее клеток. Гамма-ретровирусы могут проникать в ядра только делящихся клеток*, в то время как ленти- (ВИЧ), адено- и аденоассоциированные вирусы — в любые ядра, однако их серотипы отличаются по тропизму к разным тканям.

*  — О генотерапии онкозаболеваний: «Генная терапия против рака» [8] — Ред.

Ретровирусные системы довольно ёмкие (в капсиды можно утрамбовать 7 тыс. рибонуклеотидов), малоиммуногенные, однако встраиваются в хромосомы чуть избирательнее, чем «от балды». Для повышения специфичности встраивания ученые связывают их интегразу с «навигаторами» типа белковых доменов «цинковые пальцы». Или вовсе лишают вектор интегразы, обрекая его на эписомное существование, очень недолгое в делящихся клетках: вектор-то не реплицируется, и его концентрация (вместе с лечебным эффектом) со временем «разбавляется». Но все-таки в случае с ретровирусами это самый безопасный вариант, поскольку трудно предсказать последствия встраивания вектора, да еще с промоторами и энхансерами, в случайные места. Например, документировано несколько случаев клональной экспансии и лейкемии вследствие инсерции лентивирусной терапевтической конструкции в протоонкогены [7].

Аденовирусы не умеют встраиваться в геном хозяина, чрезвычайно ёмки (можно упаковать ДНК размером до 35 т.п.н.), но очень иммуногенны и способны вызывать сильнейшие воспалительные реакции. Более того, каждый человек имеет антитела к большинству их серотипов, что снижает эффект генотерапии. И как только исследователям не приходится изворачиваться — подбирать редкие серотипы, мутировать поверхностные белки! А вот «разбавления» вектору в любом случае не избежать...

Аденоассоциированные вирусы (AAV), содержащие одноцепочечную ДНК, почти всем хороши: не вызывают болезней у человека (потому и иммунная система их почти игнорирует), обладают тропизмом к разным тканям, могут производить терапевтические продукты как в виде эписом, так и очень быстро и даже специфично рекомбинировав с хромосомной ДНК. Одно плохо: клонировать в такие векторы можно до 4,5 тыс. нуклеотидов — капсиды миниатюрные. И на некоторые серотипы иммунная система таки реагирует, что выяснилось уже в клинических испытаниях. Для генотерапии создают рекомбинантные, лишенные вирусных генов, AAV-серотипы с тропностью к нужной ткани (rAAV1–rAAV9). Если нужно получить эписому, то лечебный ген с промотором встраивают между оставшимися от вирусной ДНК инвертированными концевыми повторами. В настоящее время проводятся клинические испытания гепатотропной конструкции, содержащей нормальный ген антигемофильного фактора IX [9]. Авторы работы усилили экспрессию фактора упаковкой в вирион самокомплементарного димера вектора и «переодели» иммуногенный AAV2 в более «нейтральный» капсид AAV8. Замещающий эффект — 2–11% от нормального уровня FIX — в I/II фазах был достигнут, однако с повышением «дозы» вектора повышался и уровень трансаминаз — печень выражала лtгкое недовольство.

Но главное, что вызывает опасения, — краткосрочность терапевтического эффекта трансгенов в эписомных векторах, особенно в делящихся клетках (например, у детей или при некоторых болезнях), а повторное введение вряд ли будет эффективным из-за образовавшихся антител. Ну и привнесение чужеродного промотора, конечно. Расследование нескольких случаев карциномы печени у мышей, которым ввели промотор- и энхансер-содержащий rAAV-вектор, установило связь онкогенеза с инсерцией вектора в хромосому 12 [10]. Встраивание произошло благодаря микрогомологиям между rAAV и хромосомой в районе генов Rian и Mirg, кодирующих множество мяРНК и микроРНК. В результате «переэкспрессии» этих генов аномально активировались другие, и происходила клональная экспансия клеток с нелегитимной инсерцией.

Ясно, что для стабильной экспрессии трансгена в любой ткани идеальный вариант — интеграция в хромосому, но интеграция специфичная, в конкретное место. Логичным кажется, например, прямое замещение дефектного участка ДНК нормальным. В этом направлении развиваются терапевтические подходы, основанные на использовании нуклеаз, редактирующих человеческий геном (ZFN, TALEN и CRISPR/Cas9). Это химеры из двух модулей, один из которых распознает определенную олигонуклеотидную последовательность, а другой (у ZFN и TALEN — домен эндонуклеазы FokI) режет обе цепи ДНК [11]. «Распознающий», обеспечивающий специфичность нуклеазы, модуль у ZFN, например, представлен протеиновым доменом «цинковые пальцы». Двухцепочечные разрезы могут репарироваться с образованием небольших инсерций/делеций и смещением рамок считывания, либо в них можно встроить нужные гены: просто «пришить» (негомологичная интеграция) или же «подогнать» фрагмент с участками гомологии (гомологичная интеграция/рекомбинация). Обычно в клетки вводят два вектора: один несет ген нуклеазы под промотором, второй — терапевтический ген с промотором или без. Двухвекторную систему с нуклеазой «цинковые пальцы» уже успешно применили in vivo, сократив время свертывания крови у мышей, страдающих гемофилией B [12].

Несмотря на обеспечение специфичности встраивания, не удаётся полностью избежать нецелевой (off-target) интеграции. Но даже в случае её преодоления никто не даст гарантии, что куда-нибудь не внедрится второй, эндонуклеазный, вектор. Да и как обеспечить лишь кратковременный синтез нуклеазы — ведь она не должна кромсать геном вечно, а лишь открыть «ворота» для лечебного гена? Некоторые предлагают совсем не вводить векторы с геном ZFN, а запускать уже «готовый» фермент, поскольку клеточные мембраны для него проницаемы. Раз нового синтеза не будет, нуклеаза постепенно элиминируется из клеточной популяции, снизив и частоту off-target-мутагенеза. Тем не менее, in situ-редактирование нуклеазами сопряжено с высоким риском развития неконтролируемого клеточного ответа на повреждение ДНК, иммуногенностью, стимуляцией хромосомных аберраций. Не говоря уже об активации соседних генов вносимыми промоторами. И все же у химерных рестриктаз огромное и светлое будущее если не в генной терапии, то в молекулярной биологии, связанной с изучением функций генов и получением изощренных мутаций, — без прецизионной инженерии теперь никуда!

Анализ накопленного опыта применения описанных генотерапевтических подходов побудил группу Ади Барцеля, работающую с мутантными по гену F9 мышами-гемофиликами, сделать ставку на аденоассоциированные вирусы (rAAV) и специфичную интеграцию. Только ещё и беспромоторную, и осуществляемую посредством гомологичной рекомбинации без всяких нуклеаз [1].

Мы свой, мы новый ген построим...

Рисунок 2. Схема конструирования вектора и экспрессии трансгена. Описание приведено в тексте. Темно-серые боксы справа — ДНК за пределами Alb. Конечные продукты: альбумин с «хвостиком» — С-концевыми аминокислотами 2A-пептида, фактор IX с пролином (Р) от 2A-пептида на N-конце. Схема из [1] с дополнениями.

Фактор свертывания крови IX кодируется геном F9 в X-хромосоме, а синтезируется в печени. Печень вообще удобный объект для опробирования многих генотерапевтических подходов из-за особенностей кровоснабжения и способности к регенерации: вводишь препарат в кровь — он идет в печень, синтезируется продукт в печени — разносится кровью по всему организму, отрезаешь 2/3 печени, а она восстанавливается. Последнее свойство используется для контроля интеграции лечебных генов в хромосому: эписомы в делящихся клетках растущего органа «разбавляются», в отличие от размножающихся вместе с ДНК хозяина «вставок».

Выбранный калифорнийским коллективом для доставки лечебного гена в мышей агент, rAAV8, обладает тропностью именно к гепатоцитам и считается малоиммуногенным. В печени непрерывно синтезируется альбумин (Alb) — доминирующий белок плазмы. Стабильную экспрессию его гена обеспечивает сильный промотор. Ади Барцель и его коллеги посчитали, что промотор альбумина выдюжит и еще один ген. «Приживалкой» должен был стать нормальный вариант человеческого гена F9. Идея интеграции «антигемофильных» кассет в Alb-локус животных не нова, однако реализовывалась она с помощью нуклеаз. Как же создавался «калифорнийский» вектор?

Прежде всего ученые амплифицировали 2,7-т.п.н. участок мышиного гена альбумина, содержащий примерно в середине стоп-кодон (рис. 2), клонировали его между вирусными инвертированными концевыми повторами. А вот дальше авторы использовали новомодный трюк — непосредственно перед альбуминовым стоп-сигналом ввели оптимизированный по кодонам человеческий ген F9, а прямо перед ним — ДНК-фрагмент, кодирующий 2А-пептид (см. справку по 2А-пептидам). В целевой конструкции гены Alb и F9 должны ко-транскрибироваться с единственного Alb-промотора, а трансляция F9 следовать сразу за трансляцией Alb, но полипептиды не будут связаны физически. Специфичность интеграции в геном гепатоцитов должны обеспечивать два (5′ и 3′) плеча гомологии.

Для снижения вероятности экспрессии кассеты в возможных местах нецелевой интеграции вектора AAV8-F9 авторы работы предусмотрели отсутствие старт-кодона ATG перед F9, 2А и предшествующим экзоном Alb. А в качестве отрицательного контроля получили такую же конструкцию, но с инвертированным по отношению к плечам гомологии фрагментом 2A-F9. При целевой интеграции «перевертыша» фактор IX (FIX) синтезироваться не будет, т.к. ген «увернулся» от контроля Alb-промотора, а вот в случае нецелевой встройки фактор в мышиной крови может и появиться.

И стар и млад мышиный рад — их гемостаз пошёл на лад

Рисунок 3. Экспрессия человеческого фактора IX (уровень FIX в плазме по данным ELISA) у взрослых мышей, которым в 9-недельном возрасте ввели либо терапевтическую конструкцию (AAV8-F9 получили 7 особей), либо инвертированную (получили 3 особи), либо плазмидную (получили 3 особи). Пунктирными линиями ограничен диапазон 5–20% от нормального уровня FIX. Рисунок из [1].

Первым делом терапевтический вектор внутрибрюшинно ввели шести двухдневным мышатам в количестве 2,5×1011 молекул на особь, а контрольный — трем. Начиная с четвертой недели, иммуноферментным анализом (ELISA) еженедельно определяли уровни фактора IX в плазме мышат. У экспериментальной группы уже во время первого измерения они вышли на плато 350–1000 нг/мл (7–20% от нормы). Известно, что достижение даже 1–2% может улучшить качество жизни людей, страдающих гемофилией, а 5–20% — радикально снизить кровоточивость. В контрольной группе плазменные уровни фактора IX оставались за пределом детекции, что указывает на отсутствие нецелевого встраивания (или его неуловимо редкие случаи). Эписомную экспрессию исключило быстрое восстановление терапевтического уровня фактора IX после удаления 2/3 печени.

Чтобы исключить зависимость целевой интеграции и высокой экспрессии AAV8-F9 от деления клеток (при развитии новорожденного), терапевтический и контрольный вектор (1×1012 молекулы на особь) ввели взрослым мышам в хвостовую вену (это малоинвазивно, что необходимо соблюдать при гемофилии). Еще одним контролем служила гидродинамически введенная в печень плазмида с геном F9 в «правильной ориентации». Как и в случае с новорожденными грызунами, антигемофильный фактор синтезировался на уровне 7–20% от нормы (рис. 3). С уменьшением «дозы» терапевтической конструкции снижался и уровень фактора IX. Контрольные векторы «молчали». Значит, для целевой интеграции необходим rAAV8.

Биологическая активность фактора, кодируемого трансгеном, у мышей-пациентов достоверно не отличалась от таковой у здоровых мышей, т.е. время коагуляции нормализовалось. Локализацию терапевтического конструкта в печени подтвердили иммуногистохимически (своими глазами, можно сказать, увидели). Вестерн-блоттингом для верности показали, что в печени синтезируется фактор IX нужного размера, т.е. рибосома честно «прыгает» при трансляции 2А-пептида, и фактор процессируется должным образом.

Доказательств много не бывает

Да, хоть и сложно продумывать все нюансы эксперимента и доказывать его успешность, чтобы потом ни один рецензент не подкопался, но в случае генотерапии на кону стоит не только публикация в Nature, а чье-то здоровье. Потому группа А. Барцеля потрудилась на славу.

С помощью количественной ПЦР (qPCR) было показано, что интеграция AAV8-F9 произошла в среднем в 0,5% аллелей Alb как у новорожденных, так и у взрослых мышей. Кажется, что это ничтожное число, однако авторы работы не рассчитывали и на такое — ведь они даже не использовали специфические нуклеазы, а гепатоциты взрослых мышей почти не делились. Сравнительно высокий процент интеграции ученые пока могут объяснить только высоким уровнем экспрессии в локусе Alb и связанным с ним «гостеприимным» состоянием хроматина. Исключить на 100% возможность клеточной пролиферации, связанной с повреждением хромосом вектором, авторы не могут, однако они не наблюдали ни одного случая повышения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ).

Конечно, коллектив больше всего заботила специфичность встраивания терапевтической кассеты, подтверждаемая в том числе и неразрывной связью экспрессии генов Alb и F9. С помощью количественной ОТ-ПЦР (qRT-PCR) удалось показать, что F9 транскрибируется исключительно (или почти) в виде «сшивки» Alb-F9, т.е. из целевой области под Alb-промотором.

Нозерн-блоттинг с зондом к РНК 2А-пептида выявил только «сшитые» транскрипты Alb-2А-F9, а вестерн-блоттинг с антителами к самому пептиду — что он появляется только совместно с альбумином, то есть, опять же, кодируется кассетой в «правильном» месте и рибосомой манипулирует «правильно».

Вроде бы стройно все получается...

Сомнения и перспективы

Настоящий учёный не перестаёт сомневаться, даже если теория железобетонная и результаты экспериментов проверены и перепроверены. А. Барцеля и соавторов статьи [1], в частности, беспокоит следующее:

1. Не будут ли цитотоксичными rAAV-векторы вообще и такие, как у них, но с другими активно экспрессирующимися терапевтическими трансгенами, в частности? (Хотя повышения трансаминаз в своем исследовании калифорнийцы не наблюдали).
2. Не проявится ли иммуногенность 2A-пептида? (Хотя в клинических испытаниях с использованием лимфотропного вектора, кодирующего такой пептид, иммунных реакций не наблюдали).
3. Не повлияет ли такая высокая «доза» вектора на повышение нецелевого встраивания и иммуногенности? (Хотя, опять же, у их мышей АЛТ не повышалась, а нецелевой экспрессии зафиксировано не было). По мнению авторов, в дальнейшем нужно использовать наиболее «тканеизбирательные» AAV-серотипы и/или гиперактивные F9-варианты.
4. Не снизится ли эффективность терапии из-за падения гомологии вектора с человеческим целевым локусом в связи с генетическим полиморфизмом последнего? (Хотя в человеческой популяции в Alb-локусе преобладают всего два гаплотипа).

Несмотря на понятную осторожность, Ади Барцель и коллеги считают, что их беспромоторная и безнуклеазная интегративная rAAV-стратегия — идеальный кандидат для проведения клинических испытаний не только с целью терапии гемофилии и иных генетических дефектов, но и для компенсации каких-то состояний секрецией нужных белков. Конечно, этот подход не слишком напоминает идеал — замену бракованной детали, но сулит, возможно, самое маленькое кладбище (как у хорошего врача) по сравнению с ранними и даже зреющими методиками генной терапии.

Литература

1. Barzel A., Paulk N.K., Shi Y., Huang Y., Chu K., Zhang F. et al (2015). Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice. Nature. 517, 360–364;
2. Genetics Home Reference — «домашний путеводитель» по генетическим заболеваниям и состояниям человека Национальной медицинской библиотеки (США);
3. Как работает свертывание крови?;
4. UZRF (портал учреждений здравоохранения РФ): «Болезнь царской крови»;
5. «Методическое пособие по гематологии» (сайт Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова);
6. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал;
7. Biopreparaty-magazine: «Генотерапевтические векторные системы на основе вирусов»;
8. Генная терапия против рака;
9. Nathwani A.C., Tuddenham E.G.D., Rangarajan S., Rosales C., McIntosh J., Linch D.C. et al. (2011). Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N. Engl. J. Med. 365, 2357–2365;
10. Donsante A., Miller D.G., Li Y., Vogler C., Brunt E.M., Russell D.W., Sands M.S. (2007). AAV vector integration sites inmouse hepatocellular carcinoma. Science. 317: 477;
11. Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. III. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397–405;
12. Li H., Haurigot V., Doyon Y., Li T., Wong S.Y., Bhagwat A.S. et al. (2011). In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature. 475, 217–221;
13. Пептид 2A: два в одном;
14. ExPASy (биоинформатический портал): Ribosomal skipping.