Исследователи из Гарвардского университета вместе с коллегами из Массачусетского технологического института создали новую версию системы CRISPR под названием SHERLOCK, которую можно использовать для диагностики рака, а также таких опасных инфекций, как вирус Зика и лихорадка денге. Ученые представили результаты своей работы в журнале Science.
CRISPR/Cas9 — это технология редактирования генома организмов, базирующаяся на иммунной системе бактерий. Основой этой системы являются особые участки бактериальной ДНК — CRISPR — короткие палиндромные кластерные повторы в геноме бактерий, содержащие ДНК вирусы, паразитирующие на данном штамме бактерий. При попадании вируса в бактериальную клетку он обнаруживается с помощью специальных Cas-белков, связанных с CRISPR РНК. Если фрагмент вируса «записан» в спейсере CRISPR РНК, Cas-белки разрезают вирусную ДНК и уничтожают ее.
Таким образом, CRISPR — это своего рода иммунная система бактерий, состоящая из геномных кассет, куда бактерия записывает информацию о вирусе (встраивает часть генома вируса в кассету), с которым ей случилось контактировать. Таким образом, если этот вирус снова атакует бактерию, она даст ему мощный отпор.
Для этого Cas13a патогенной бактерии Leptotrichia shahii инкубировали с репортерной РНК, целевой РНК (ssRNA 1) и CRISPR РНК (crRNA). В кассете последней при этом были закодированы фрагменты ssRNA 1 — она служит для нуклеазы «шпаргалкой» при поиске мишени. Анализ показал, что система хорошо справляется с детекцией in vitro, однако для достижения аттомолярной чувствительности авторам потребовалось подобрать оптимальные условия предварительной амлификации (увеличения нуклеиновых кислот). Нужного уровня точности удалось достичь путем рекомбиназной полимеразной амплификации (увеличения числа копий ДНК).
 |
| Схема работы SHERLOCK. После конвертации ДНК в РНК в «библиотеке» последней находят мишень с помощью CRISPR-Cas13a, несущей эталон целевой последовательности. Разрушение РНК приводит к флуоресценции |
После конвертации ДНК в РНК Cas13a детектировал целевую последовательность, сравнивая ее с закодированной в CRISPR, и разрезал другие РНК. Нуклеаза также уничтожила репортерную РНК — на обнаружение мишени указывала флуоресценция поврежденной молекулы. Методы цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) — одного из основных способов детекции нуклеиновых кислот — подтвердили, что для работы новой системе необходима только одна молекула ДНК или РНК. При этом, по сравнению с традиционными техниками, она обладает меньшей вариабельностью результатов при многократных повторах.
В своем предыдущем исследовании команда ученых обнаружила фермент под названием Cas13a, который способен специфически уничтожать нужную РНК. В отличие от системы CRISPR/Cas9, система CRISPR/Cas13a действует на уровне РНК, а не ДНК. У некоторых вирусов именно РНК, а не ДНК, является носителем генетической информации. Ученые назвали систему CRISPR/Cas13a «суицидальной», так как после распознавания чужеродной РНК фермент Cas13a начинает уничтожать все молекулы РНК вокруг.
Исследователям пришла мысль использовать этот РНК-узнавающий фермент для диагностики вирусов. Однако, чтобы метод действительно работал, требуется большое количество молекул вирусных РНК, а образце крови или мочи больного их может быть не очень много.
Теперь ученые придумали, как сделать метод диагностики на основе системы CRISPR/Cas13a более чувствительным. Зная то, что фермент Cas13a начинает уничтожать все молекулы РНК вокруг после того, как найдет «плохие» РНК (например, вирусные), ученые решили добавить к системе обнаружения особую РНК, которая при разрушении ферментом начинает светиться. А чтобы Cas13a заметил даже небольшое количество «плохих» РНК, исследователи использовали рекомбиназную полимеразную амплификацию — технологию, позволяющую многократно размножать присутствующую в образце РНК.
По словам ученых, эта диагностическая система будет выглядеть как тест на беременность и сможет легко применяться, например, во время вспышек инфекционных заболеваний в Африке. Этот тест позволит диагностировать различные бактериальные инфекции, а также сможет обнаружить рак.