Американские биологи расшифровали механизм, помогающий туберкулезной палочке и другим микобактериям противостоять антимикробным препаратам. При делении палочковидных бактерий каждая дочерняя клетка наследует один из своих концов (полюсов) от родительской клетки, а второй формируется заново в процессе деления. Поэтому у каждой клетки один из полюсов всегда новый, а возраст второго варьирует в широких пределах. Как выяснилось, генLamA, функция которого до сих пор была неизвестна, тормозит рост недавно образовавшихся полюсов. Из-за этого клетки растут асимметрично (один конец быстрее другого), и даже генетически идентичные бактерии сильно различаются по скорости роста, а заодно и по устойчивости к антибиотикам. Таким образом, ген LamA повышает фенотипическую изменчивость бактерий при неизменном геноме. Если его отключить, изменчивость снижается, и популяцию микобактерий становится проще уничтожить антибиотиками.

Микобактерии (см. также Mycobacterium), к которым относятся возбудители туберкулеза и проказы, обладают рядом особенностей, из-за которых с ними трудно бороться. Например, при лечении туберкулеза приходится принимать антибиотики очень долго, чтобы избежать рецидива, хотя большинство туберкулезных палочек (Mycobacterium tuberculosis) погибает в самом начале лечения. Дело в том, что некоторая часть популяции сохраняет жизнеспособность еще долго после гибели основной массы бактерий. Самое интересное, что выжившие микробы могут генетически ничем не отличаться от погибших. Иными словами, у микобактерий имеется большая ненаследственная изменчивость по устойчивости к антибиотикам.

Рис. 1. Современные технологии позволяют следить за ростом и делением бактериальных клеток в реальном времени, параллельно регистрируя активность генов (см.: Time-lapse microscopy). Верхний ряд кадров показывает рост группы микобактерий. В среднем и нижнем рядах стрелками показано скопление белков FtsZ и LamA в районе образования септы (там, где клетка собирается поделиться). Интервал между кадрами 15 минут, длина масштабного отрезка 5 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature

Микобактерии фактически создают фенотипическое разнообразие при каждом делении, не меняя своего генома. Две микобактерии, образовавшиеся в результате деления одной и той же материнской клетки, могут различаться по скорости роста. Палочковидные клетки микобактерий (рис. 1) растут на концах (полюсах), и часто один полюс у них растет быстрее другого. Та дочерняя клетка, которая при делении унаследует быстро растущий полюс материнской клетки, будет расти быстрее, чем ее сестра, которой достался медленно растущий полюс. Поскольку медленно растущие клетки микобактерий делятся примерно с той же частотой, что и быстро растущие (деление микобактерий контролируется «биологическими часами», а не размером клетки), изменчивость по скорости роста порождает изменчивость по размеру клеток. Также известно, что генетически одинаковые микобактерии, различающиеся по размеру и скорости роста, могут иметь разную степень восприимчивости к антибиотикам (B. B. Aldridge et al., 2012. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility).

Из этого следует, что для разработки эффективных стратегий борьбы с микобактериальными инфекциями, включая туберкулез, было бы полезно научиться контролировать работу молекулярных механизмов, позволяющих микобактериям быть разнообразными при одном и том же геноме. Но для этого упомянутые механизмы нужно сначала выявить и изучить. Именно это и попытались сделать биологи из Гарвардской школы здравоохранения им. Т. Х. Чана в Бостоне (Harvard T. H. Chan School of Public Health), чья статья опубликована в свежем выпуске журнала Nature.

Большая часть экспериментов проводилась с безвредной микобактерией M. smegmatis, которая растет быстрее, чем туберкулезная палочка, и поэтому работать с ней удобнее. Авторы использовали краситель кальцеин-АМ (см. Calcein), который проникает в бактериальную клетку путем диффузии. В цитоплазме кальцеин-АМ подвергается действию ферментов эстераз и превращается во флуоресцирующий кальцеин, не способный диффундировать обратно через мембрану, если только какие-нибудь транспортные белки не будут его активно выкачивать.

Эксперименты подтвердили, что микобактерии генерируют фенотипическое разнообразие в процессе деления. Когда равномерно флуоресцирующая родительская клетка делится, одна из ее дочек вскоре начинает флуоресцировать сильнее, чем другая. В большинстве случаев ярче флуоресцирует та дочка, которой достался «молодой» полюс материнской клетки (рис. 2, a, b). Это значит, что дочки различаются либо по активности эстераз, либо по проницаемости мембраны и клеточной стенки, и эти различия как-то связаны с возрастом клеточных полюсов.

Затем исследователи проверили, коррелирует ли сила флуоресценции с устойчивостью к антибиотику рифампицину, которым лечат туберкулез. Пронаблюдав за судьбой 96 индивидуальных клеток, которые сначала окрашивали кальцеином-АМ, а потом подвергали действию антибиотика, авторы обнаружили, что такая корреляция действительно существует: рифампицин сильнее действует на те клетки, которые ярче флуоресцируют, то есть накапливают больше кальцеина (рис. 2, c, d).

Рис. 2. Окрашивание кальцеином позволяет выявить изменчивость клеток по устойчивости к антибиотику рифампицину. a — изменчивость клеток по силе флуоресценции после окрашивания кальцеином. По горизонтальной оси — сила флуоресценции, по вертикальной — количество клеток. Размах изменчивости очень велик по сравнению с тем, что обычно наблюдается у других бактерий. b — график, показывающий, что из двух сестринских клеток сильнее, как правило, флуоресцирует та, которая унаследовала от родительской клетки ее «молодой» конец. По горизонтальной оси — отношение силы флуоресценции дочерней клетки, которой достался молодой полюс матери, к силе флуоресценции ее сестры, которой достался старый полюс. с — схема эксперимента по выявлению связи между силой флуоресценции и устойчивостью к рифампицину. d — график, показывающий, что рифампицин сильнее действует на клетки, которые ярче флуоресцируют, то есть накопили больше кальцеина. По горизонтальной оси — сила флуоресценции, по вертикальной — суммарное число потомков, произведенных клеткой за 6 часов жизни в среде с рифампицином и последующие 12 часов жизни в обычной питательной среде. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, по силе флуоресценции можно примерно оценить устойчивость бактерии к рифампицину. Но как объяснить эту корреляцию? Сам по себе краситель вряд ли влияет на устойчивость к антибиотику. Скорее можно предположить, что клетки, накапливающие больше кальцеина, легче пропускают через свою мембрану также и рифампицин. То есть, возможно, дело тут в проницаемости мембраны и в работе каких-то белков, регулирующих транспорт различных молекул (в том числе кальцеина и рифампицина) из внешней среды в цитоплазму и обратно. Дальнейшие эксперименты косвенно подтвердили это предположение.

Чтобы выявить гены, влияющие на изменчивость бактерий по окрашиванию кальцеином и по устойчивости к рифампицину, авторы воспользовались методом транспозонного мутагенеза (см. Transposon mutagenesis). Транспозоны встраиваются в разные места бактериального генома, выводя из строя те гены, в которые они встроились. Полученных таким способом микобактерий-мутантов разделили на восемь групп по силе флуоресценции при окрашивании кальцеином. Последующее секвенирование позволило установить, в какие гены встроились транспозоны в пределах каждой из восьми групп.

Так были выявлены гены, поломка которых приводит к наиболее сильному и статистически значимому росту или снижению флуоресценции. В соответствии с ожиданиями исследователей оказалось, что многие из этих генов кодируют белки, прямо или косвенно связанные с проницаемостью клеточной стенки или с транспортом молекул через клеточную мембрану.

Для дальнейшего анализа были отобраны восемь генов с самым сильным влиянием на флуоресценцию. Авторы изготовили восемь штаммов генетически модифицированных микобактерий, у которых один из этих генов был удален, и дальнейшие опыты проводили с этими штаммами. Во всех случаях удаление гена повлияло на флуоресценцию так же, как и встройка в этот ген транспозона.

Исследователи ожидали, что удаление некоторых (но не всех!) влияющих на флуоресценцию генов повлияет также и на устойчивость к рифампицину. А именно, если функция гена связана с проницаемостью мембраны или клеточной стенки (это справедливо для пяти из восьми отобранных генов), то его удаление может повлиять одновременно и на флуоресценцию, и на устойчивость. Если же ген кодирует один из ферментов-эстераз, превращающих кальцеин-АМ во флуоресцирующий кальцеин (таких генов среди восьми отобранных оказалось два), то его удаление, скорее всего, повлияет только на флуоресценцию, но не на устойчивость к рифампицину. Это предположение было проверено и блестяще подтвердилось.

Один из восьми генов привлек особенно пристальное внимание исследователей. Дело в том, что его удаление не только увеличило среднюю интенсивность флуоресценции и среднюю чувствительность к рифампицину, но и резко снизило изменчивость бактерий по обоим этим признакам.

Данный ген ранее назывался mmpS3. Эти буквы, по-видимому, намекают на микобактерий и на то, что кодируемый белок, судя по его аминокислотной последовательности, локализуется в клеточной мембране (Mycobacterium membrane protein). Что конкретно этот белок делает, никто не знал. Авторы переименовали ген в lamA (loss of asymmetry mutant A), поскольку оказалось, что мутанты, лишенные этого гена, отличаются от бактерий дикого типа более симметричным ростом (рис. 3). Ген lamA есть у всех микобактерий, но отсутствует у других организмов.

Рис. 3. Микобактерии, лишенные гена lamA (ΔlamA, голубые значки), растут симметричнее, чем бактерии дикого типа (WT, серые значки). Слева — график, показывающий соотношение скоростей роста нового (New) и старого (Old) полюсов у индивидуальных бактерий в среднем за весь жизненный цикл (от деления до деления). Видно, что у бактерий дикого типа старый полюс растет гораздо быстрее нового, а у мутантов эта асимметрия выражена слабее. Справа — усредненная динамика роста старого (пустые кружочки) и нового (заполненные кружочки) полюсов. Видно, что общая скорость роста клеток, которую можно оценить как сумму скоростей роста двух полюсов, примерно одинакова у обычных бактерий и мутантов. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

У обычных микобактерий новый полюс растет намного медленнее старого. У мутантов, лишенных гена lamA, разница в скорости роста полюсов существенно меньше. При этом общая скорость роста клеток, равная сумме скоростей роста двух полюсов, примерно одинакова у мутантов и диких бактерий. Та же закономерность — повышенная симметричность роста мутантов — выявляется и при сравнении скоростей роста дочерних клеток, образовавшихся в результате деления одной и той же материнской клетки. У обычных микобактерий, как мы помним, та дочка, которой достался молодой полюс материнской клетки, растет медленнее, чем та, что унаследовала старый полюс (рис 2, b). У мутантов ΔlamA эта разница выражена на 60% слабее. В результате и размах ненаследуемой изменчивости по скорости роста у мутантов намного меньше. То же самое справедливо и для изменчивости по размеру клеток, измеренных непосредственно перед делением (рис. 4). Таким образом, один из фенотипических эффектов гена lamA состоит в увеличении ненаследуемой изменчивости и разнообразия популяции. Данный ген можно без большой натяжки назвать «геном разнообразия».

Рис. 4. Изменчивость по размеру клеток, измеренных непосредственно перед делением (Mother cell length), у микобактерий дикого типа (WT) больше, чем у мутантов, лишенных гена lamA (ΔlamA). По горизонтальной оси — длина клетки, по вертикальной — число клеток данной длины. CV — коэффициент вариации. Было измерено по 120 клеток каждого типа. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

У мутантов ΔlamA также оказалась резко понижена изменчивость по устойчивости к рифампицину и нескольким другим антибиотикам. Это проявляется в том, что по мере роста концентрации антибиотика численность обычных микобактерий снижается медленно и постепенно, тогда как у мутантов, лишенных гена lamA, по достижении некоторой пороговой концентрации антибиотика происходит резкий спад численности практически до нуля. Таким образом, в популяции мутантов нет подмножества особо стойких индивидов, из-за которых так трудно до конца вылечить туберкулез.

Тесты на устойчивость к антибиотикам были проведены не только на безвредной M. smegmatis, но и на туберкулезной палочке M. tuberculosis, для которой тоже была получена мутантная линия, лишенная гена lamA. Тесты подтвердили, что этих мутантов легче истребить антибиотиком, чем обычных M. tuberculosis.

Дополнительные эксперименты показали, что белковый продукт гена lamA входит в состав «дивисомы» (divisome) — белкового комплекса, обеспечивающего клеточное деление у бактерий (см.: V. W. Rowlett & W. Margolin, 2015. The bacterial divisome: ready for its close-up). Как и другие белки дивисомы, lamA концентрируется там, где происходит формирование перегородки (септы) между делящимися клетками. Таким образом, после деления больше всего этого белка оказывается на молодом полюсе клетки. Судя по всему, белок lamA замедляет рост клеточной стенки, хотя конкретный молекулярный механизм этого замедления остался неизвестным. Это объясняет, по крайней мере отчасти, почему молодой полюс растет медленнее старого. Искусственная гиперактивация гена lamA приводит к тому, что клетки вообще начинают расти медленнее, а их средний размер резко уменьшается. Впрочем, связь между активностью lamA и скоростью роста клеток явно не так проста и однозначна: ведь мы знаем, что удаление этого гена не приводит к общему замедлению роста, а лишь делает этот рост более асимметричным.

Несмотря на большой объем проделанной работы, многие вопросы так и остались неразрешенными. В частности, осталась неясной природа связи между lamA, ростом клеток и устойчивостью к антибиотикам. Можно предположить, что более симметричный рост клетки способствует ускоренному поступлению антибиотика в цитоплазму, но непонятно, почему это так, да и сам факт требует дополнительных проверок.

Полученные результаты, возможно, пригодятся для разработки новых способов борьбы с туберкулезом. Не исключено, что препараты, подавляющие активность lamA или иным способом снижающие ненаследственную фенотипическую изменчивость микобактерий, позволят повысить эффективность лечения антибиотиками.

Кроме того, новые данные полезны для понимания общих принципов кодирования фенотипа в геноме. На примере lamA можно видеть, как белок, выполняющий вполне определенную морфогенетическую функцию (которая в данном случае состоит в замедлении роста молодых полюсов клеток), придает фенотипу неопределенность (изменчивость). Этот повышающий фенотипическое разнообразие эффект, очевидно, обусловлен тем, что в популяции палочковидных бактерий неизбежно присутствует огромная изменчивость по возрасту «старых» полюсов клеток. Белок lamA превращает эту исходно малозаметную и несущественную для жизни бактерий вариабельность в бросающуюся в глаза и важную для выживания изменчивость по скорости роста и размеру клеток. Гены с обратным эффектом, упорядочивающие развитие и тем самым снижающие изменчивость и фенотипическое разнообразие популяции, хорошо известны. Повреждение таких генов ведет к росту изменчивости. Пример гена lamA показывает, что возможна и противоположная ситуация, когда повреждение гена ведет к унификации фенотипа и уменьшению изменчивости.

Источник: E. Hesper Rego, Rebecca E. Audette & Eric J. Rubin. Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity // Nature. 2017. V. 546. P. 153–157. DOI: 10.1038/nature22361.