Ученые из Бостонского университета впервые создали широкомасштабную систему генетических блоков, позволяющую программировать действия человеческих клеток с применением булевой алгебры. Статья опубликована в Nature Biotechnology.

Система, которую ученые назвали BLADE (Boolean logic and arithmetic through DNA excision), позволяет контролировать внутриклеточные процессы с помощью рекомбиназ. Рекомбиназы — это ферменты, которые умеют разрезать и сшивать нить ДНК и способны работать и как активаторы, и как репрессоры транскрипции. Активация может быть достигнута, например, при вырезании области терминатора транскрипции, расположенного перед интересующим геном (ИГ), или при разворачивании ИГ в правильную сторону относительно промотора. В свою очередь, репрессия может быть достигнута вырезанием самого ИГ или разворачиванием его в неправильную сторону. Вырезать по вышеописанной схеме умеют тирозин-зависимые рекомбиназы, а разворачивать — серин-зависимые. Для них в «текст» ДНК помещают специальные сайты — специфические последовательности из нескольких нуклеотидов по обе стороны от нужного участка, которые рекомбиназы узнают и приступают к работе. Ученые протестировали работу двенадцати рекомбиназ в почечных эмбриональных клетках человека и выбрали две наиболее подходящие — Cre и Flp, которые функционируют совершенно независимо друг от друга.

16 типов логических значений (булевых операторов), реализованных с помощью разного расположения сайтов двух рекомбиназ

Возможность по-разному располагать сайты этих двух рекомбиназ относительно последовательности ИГ и его терминатора позволила ученым разработать соответствующие схемы для всех шестнадцати существующих логических значений (булевых операторов), таких как «И» и «ИЛИ», и использовать их для создания логической системы с N вводами (в описанном выше случае N=2, по числу типов рекомбиназ) и M состояниями. В результате сочетания таких операторов в ДНК можно путем их «включения» и «выключения» добиться сложной регуляции работы генов в клетке. Кроме того, разнообразить работу рекомбиназ позволило использование дополнительных сайтов, слегка мутированных — рекомбиназа зачастую работает таким образом, что узнает только совершенно одинаковые сайты (они могут быть оба мутированными или оба нормальными, но не разными).

Для того, чтобы протестировать работу системы BLADE, исследователи, в том числе, работали с четырьмя генами, кодирующими флуоресцентные белки tagBFP, EGFP, iRFP720 и mRuby2 в клетках лимфоцитов Jurkat T, используя доксициклиновую регуляцию (что позволяло дозировать эффект работы рекомбиназ). Блоки, составленные из операторов, были устроены таким образом, чтобы включать отдельные гены в четырех разных состояниях: при попадании в ядро каждой из рекомбиназ по отдельности, при отсутствии их обеих или при наличии их обеих одновременно. Эксперимент подвердил, что рекомбиназы работают правильным образом, и соответствующие белки светились в клетках даже через две недели после начала эксперимента.

Работа четырех генов, кодирующих разные флуоресцентные белки, в 4 вариантах состояний системы (вверху - до добавления доксициклина, внизу - при достижении его максимальной концентрации)

После этого ученые составили библиотеку из 113 блоков, размерами превышающую все ранее описанные библиотеки подобного типа, и протестировали работу блоков с помощью векторного теста, измеряя угол отклонения реальных результатов работы каждого из блоков от правильного направления согласно «истинной таблице», составленной заранее. Отклонение в 0° подразумевало идеальную работу блока, а угол 90° означал полное несоответствие заданного и полученного направлений. Тест показал, что 106 из 113 блоков отклонялись от заданного направления не более, чем на 15 процентов. Ни один блок не отклонился от него более, чем на 25 процентов. Кроме того, более 96 процентов блоков были ближе всего именно к своему идеальному направлению — что является самым высоким результатом среди всех подобных проектов, проводящихся, главным образом, с кишечными палочками.

После этого были проведены дополнительные эксперименты, показавшие, что работу BLADE можно совмещать с работой CRISPR-Cas9 систем. BLADE не нарушает деятельности CRISPR-Cas9 и может работать с РНК-проводниками (gRNA), снабженными соответствующими сайтами. Кроме того, работу BLADE можно контролировать, например, с помощью лекарственных средств — таких, как 4-гидроксиамоксифен, который будет «отпускать» рекомбиназы, предварительно связанные с мутированным рецептором эстрогена, и позволять им попадать в ядра тогда, когда это бывает нужно.

Это первая система генетических блоков, которая работает со столь высокой эффективностью при таком количестве операторов и протестирована на человеческих, а не на бактериальных клетках.